| License: Publishing license for publications excluding print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-508229
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.50822
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 4 October 2022 |
| Referee: | PD Dr. Max Keller |
| Date of exam: | 13 October 2021 |
| Institutions: | UNSPECIFIED |
| Keywords: | GPCR, split luciferase complementation, radioligand binding, label-free, DMR, ligand characterization, kinetic measurement, dopamine receptor |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 50822 |
Abstract (English)
The family of dopamine D2-like receptors comprises the D2, D3 and D4 receptor, which exist in different isoforms, due to alternative splicing of the mRNA or polymorphisms in the coding sequence for the respective receptor. The D2-like receptors are implicated in various pathological conditions, such as schizophrenia, Parkinson’s disease, substance abuse or attention deficit hyperactivity disorder ...
Abstract (English)
The family of dopamine D2-like receptors comprises the D2, D3 and D4 receptor, which exist in different isoforms, due to alternative splicing of the mRNA or polymorphisms in the coding sequence for the respective receptor. The D2-like receptors are implicated in various pathological conditions, such as schizophrenia, Parkinson’s disease, substance abuse or attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) among others. This renders them an important target for the development of therapeutic drugs and pharmacological tools, facilitating the elucidation of distinct functions of the receptor subtypes. For the characterization of dopamine receptor ligands regarding their affinities to the receptor subtypes and their functional properties, a variety of technologies is available. This thesis aimed at the establishment of a radioligand binding assay to enable the investigation of ligand affinities at D2long, D3 and D4.4 receptors, the most commonly occurring isoforms. Further, providing a proximal functional readout that enables the determination of agonism or antagonism of ligands, a β-arrestin2 recruitment assay was established. The label-free DMR technology yields a distal readout, generated from the response of whole cells to stimulation of an expressed receptor and was chosen to extend the pharmacological toolbox for the characterization of ligands at D2 receptors. Label-free methods have the advantage of being less prone to false negatives regarding biased ligands since the whole cell response is detected, compared to the quantification of one distinct signaling event in more traditional functional assays. Unfortunately, it was not possible to establish the DMR assay for the D3R and the D4.4R.
For the binding assay, the high affinity D2-like receptor antagonist [³H]N-methylspiperone was chosen as radioligand and binding to all three D2-like receptor subtypes was investigated using whole cells and homogenates prepared from the same cell lines. The utilization of homogenates appeared more useful, especially regarding the investigation of agonists. Agonists distinguish between high and low affinity states of the D2-like receptors, which appears undetectable when whole cell preparations are used. Further studies were carried out with cell homogenates. The binding kinetics of [³H]N-methylspiperone and the detectability of high affinity states of the D2longR, D3R and D4.4R were investigated. A library of well-known reference ligands was screened and obtained data was compared with literature reports, leading to the conclusion that the established method is a reliable tool for the determination of ligand affinities. Hence, several histamine H2 receptor agonists generated by our group could be tested for their affinities to the D2longR, D3R and D4.4R, supporting the development of histamine H2 receptor specific compounds.
By developing a β-arrestin2 recruitment assay employing the split Emerald luciferase (ELuc) technique, agonist and antagonistic properties could be determined at the D2longR and the D3R. At the D4.4R, as described in the literature, no β-arrestin recruitment could be determined. Expression of the receptor and the β-arrestin2 fusion proteins with complementary fragments of the ELuc were confirmed by radioligand binding experiments and Western Blotting. Radioligand competition binding studies were performed and showed that the modification of the receptor does not impact the ligand affinities. β-Arrestin2 recruitment to the D2longR was distinct, yielded excellent signal-to-background ratios and could be monitored in real-time using whole cells. The D3R recruited β-arrestin2 in a less pronounced manner, but by performing lysis-based endpoint measurements, robust concentration-response and inhibition curves could still be generated.
The DMR assay was established using CHO-K1 cells stably expressing the hD2longR, as CHO cells exhibit favorable adhesion properties. Assay conditions were optimized, regarding factors such as the cell seeding density or the assay temperature. Sets of reference (partial) agonists and antagonists were investigated using the DMR technique and the resulting potencies were compared to data obtained from other more conventional assays. Agonists, as well as antagonists exhibited the highest potencies in the DMR assay. The underlying reasons cannot fully be elucidated since different expression systems were used (HEK293T cells or CHO-K1 cells) for the performance of the different assays. However, the DMR assay provides a very distal readout, which is prone to signal amplification and may contribute to the comparably higher potencies. Investigations using pharmacological tools such as pertussis toxin, identified the Gi/o protein to be the main trigger of the cell response observed by DMR measurements.
Altogether, the methods described in this thesis in combination with the mini-G protein recruitment assay provide a broad range of assays for the characterization of newly synthesized compounds regarding their affinities and functional properties.
Translation of the abstract (German)
Die Dopamin D2-Rezeptorfamilie umfasst den D2, D3 und D4-Rezeptor, die aufgrund von alternativem Splicing der mRNA oder Polymorphismen in der kodierenden Sequenz für den jeweiligen Rezeptor in verschiedenen Isoformen existieren. Die D2-artigen Rezeptoren sind an verschiedenen pathologischen Zuständen beteiligt, wie z. B. Schizophrenie, Parkinson, Drogenmissbrauch oder ...
Translation of the abstract (German)
Die Dopamin D2-Rezeptorfamilie umfasst den D2, D3 und D4-Rezeptor, die aufgrund von alternativem Splicing der mRNA oder Polymorphismen in der kodierenden Sequenz für den jeweiligen Rezeptor in verschiedenen Isoformen existieren. Die D2-artigen Rezeptoren sind an verschiedenen pathologischen Zuständen beteiligt, wie z. B. Schizophrenie, Parkinson, Drogenmissbrauch oder Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS). Dies macht sie zum Gegenstand für die Entwicklung von Medikamenten und pharmakologischen Werkzeugen, die die Aufklärung der unterschiedlichen Funktionen der Rezeptor-Subtypen ermöglichen. Für die Charakterisierung von Dopaminrezeptor-Liganden hinsichtlich ihrer Affinitäten und ihrer funktionellen Eigenschaften steht eine Vielzahl von Technologien zur Verfügung. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Radioliganden-Bindungsassays, der die Bestimmung von Affinitäten an D2long-, D3- und D4.4-Rezeptoren, den am häufigsten vorkommenden Isoformen, ermöglicht. Darüber hinaus wurde ein β-Arrestin2-Rekrutierungsassay entwickelt, der ein proximales funktionelles Readout liefert und die Bestimmung von Agonismus oder Antagonismus von Liganden ermöglicht. Die DMR-Technologie liefert ein distales Readout, das aus der Antwort ganzer Zellen auf die Stimulation eines exprimierten Rezeptors gewonnen wird, und wurde gewählt, um den pharmakologischen Werkzeugkasten für die Charakterisierung von Liganden an D2-Rezeptoren zu erweitern. „Label-freie“ Methoden haben den Vorteil, dass sie weniger anfällig für falsch-negative Ergebnisse in Bezug auf funktionell selektive Liganden sind, da die Reaktion der gesamten Zelle erfasst wird, im Gegensatz zur Quantifizierung eines einzelnen Signalereignisses in traditionelleren funktionellen Assays. Leider war es nicht möglich, den DMR-Assay für den D3R und den D4.4R zu etablieren.
Für den Bindungs-Assay wurde der hochaffine Antagonist [³H]N-Methylspiperon als Radioligand gewählt. Die Bindung an allen drei Rezeptorsubtypen der D2-Familie wurde unter Verwendung von ganzen Zellen und Homogenaten, die aus denselben Zelllinien hergestellt wurden, untersucht. Die Verwendung von Homogenaten erwies sich als vorteilhafter, insbesondere bei der Untersuchung von Agonisten. Agonisten unterscheiden zwischen hoch- und niedrigaffinen Zuständen der D2-like-Rezeptoren, was bei der Verwendung von ganzen Zellen nicht nachweisbar ist. Weitere Untersuchungen wurden deshalb mit Zellhomogenaten durchgeführt. Die Bindungskinetik von [³H]N-Methylspiperon und die Nachweisbarkeit des D2longR, D3R und D4.4R im Zustand hoher Affinität wurden untersucht. Eine Auswahl bekannter Referenzliganden wurde gescreent, und die erhaltenen Daten wurden mit Literaturdaten verglichen, was zu der Schlussfolgerung führte, dass die etablierte Methode ein zuverlässiges Werkzeug für die Bestimmung von Ligandenaffinitäten ist. So konnten die von unserer Arbeitsgruppe synthetisierten Histamin-H2-Rezeptor-Agonisten auf ihre Affinität zu D2longR, D3R und D4.4R getestet werden, was die Entwicklung von Histamin-H2-Rezeptor-spezifischen Verbindungen unterstützt.
Durch die Entwicklung eines β-Arrestin2-Rekrutierungstests unter Verwendung der Split-Emerald-Luciferase-Technik (ELuc) konnten agonistische und antagonistische Eigenschaften am D2longR und am D3R bestimmt werden. Am D4.4R konnte keine β-Arrestin-Rekrutierung festgestellt werden, wie in der Literatur beschrieben ist. Die Expression des Rezeptors und der β-Arrestin2-Fusionsproteine mit den komplementären Fragmenten der ELuc wurde durch Radioligand-Bindungsexperimente und Western Blotting bestätigt. Radioligand-Verdrängungsstudien wurden durchgeführt und zeigten, dass die Modifikation des Rezeptors keinen Einfluss auf die Ligand-Affinitäten hat. Die β-Arrestin2-Rekrutierung des D2longR war eindeutig, ergab ein ausgezeichnetes Signal-Hintergrund-Verhältnis und konnte unter Verwendung ganzer Zellen in Echtzeit beobachtet werden. Der D3R rekrutierte β-Arrestin2 in geringerem Maße, aber durch die Durchführung von Lyse-basierten Endpunktmessungen konnten dennoch robuste Konzentrations-Effekt-Kurven und Inhibitionskurven erhalten werden.
Der DMR-Assay wurde mit CHO-K1-Zellen, die den hD2longR stabil exprimieren, durchgeführt, da CHO-Zellen vorteilhafte Adhäsionseigenschaften aufweisen. Die Assay-Bedingungen wurden in Bezug auf Faktoren wie die Zellaussaatdichte oder die Assay-Temperatur optimiert. Eine Reihe von (partiellen) Referenzagonisten und -antagonisten wurde mit der DMR-Technik untersucht und die erhaltenen Daten wurden mit Daten verglichen, die durch andere, konventionellere Assays gewonnen wurden. Sowohl die Agonisten als auch die Antagonisten wiesen im DMR-Assay die höchsten Potenzen auf. Die zugrundeliegenden Mechanismen können nicht vollständig aufgeklärt werden, da für die Durchführung der verschiedenen Assays unterschiedliche Expressionssysteme verwendet wurden (HEK293T- oder CHO-K1-Zellen). Der DMR-Assay liefert jedoch ein sehr distales Readout, das für eine Signalverstärkung anfällig ist und zu den vergleichsweise höheren Potenzen beitragen kann. Untersuchungen mit pharmakologischen Hilfsmitteln wie Pertussis-Toxin ergaben, dass das Gi/o-Protein der Hauptauslöser der in DMR-Messungen beobachteten Zellreaktion ist.
Insgesamt bieten die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden in Kombination mit dem Mini-G-Protein-Rekrutierungstest ein breites Spektrum an Assays zur Charakterisierung von neu synthetisierten Verbindungen hinsichtlich ihrer Affinitäten und funktionellen Eigenschaften.
Metadata last modified: 05 Oct 2022 15:37
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