| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-508688
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.50868
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 July 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Antje J. Bäumner |
| Date of exam: | 22 July 2021 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, formerly Prof. Wolfbeis) |
| Keywords: | electrochemistry, biosensor, bacteriophage, laser-induced graphene, food safety, bacterial detection, microbial detection, bioassay |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 50868 |
Abstract (English)
Access to safe and nutritious food is mandatory for sustaining life and promoting health. While contaminated food directly is connected to illness and death food safety also is closely linked to nutrition and food security, whereby a safe food supply chain is supporting national economies, trade, and tourism. Modern challenges in the food supply include a growing world population, globalization ...
Abstract (English)
Access to safe and nutritious food is mandatory for sustaining life and promoting health. While contaminated food directly is connected to illness and death food safety also is closely linked to nutrition and food security, whereby a safe food supply chain is supporting national economies, trade, and tourism. Modern challenges in the food supply include a growing world population, globalization as well as climate change, or soil degradation. While these changes affect everyone, the developing world is predominantly affected by unsafe food while suffering from a lack of infrastructure especially expensive equipment and trained personnel. To overcome these challenges biosensors are identified as promising tools to enable the monitoring of food along the whole food supply chain with the ease of their integration into mobile solutions. The fields of electrochemistry, microfluidics, and biosensors complement one another in this objective with special emphasis on novel electrode materials and detection strategies for the design of highly sensitive, reliable but cost-efficient biosensors.
Substrate-independent laser-induced graphene electrodes
Discovered in 2014 laser-induced graphene (LIG), directly derived from polyimide films, is particularly interesting with the ease of its production in contrast to other materials from the graphene family. While the growing number of publications on electrochemical sensors represent this interest the inertness of the polyimide substrate limits its integration into microfluidic devices. In addition to already established transfer techniques, a pressure-driven transfer of LIG to thermoplastic polymeric substrates was developed and the derived transferred laser-induced graphene (tLIG) was compared with LIG. Morphologically and chemically the surface of tLIG and LIG differed whereby tLIG showed a much smoother surface, resulting in a much lower electrochemically active surface area, a higher sheet resistance, and a slightly decreased electron transfer rate. Additionally, the graphene characteristic Raman 2D peak was not maintained after transfer. Besides all morphological differences, in amperometric detection both LIG compounds performed equally well for the detection of p-aminophenol, ruthenium (III) hexamine, and potassium ferrocyanide. A microfluidic chip was fabricated using adhesive tape for the indirect binding using a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microfluidic channel. Channel height and flow rate were optimized towards the sensitive amperometric detection of p-aminophenol, the product of the enzymatic conversion of p-aminophenyl phosphate by alkaline phosphatase. Alkaline phosphatase, commonly detected as a biomarker or used as a biosensing amplification system, was detected with a limit of detection of 0.3 U/L requiring a sample volume of only 40 µL.
Bioassays for microbial detection
For the detection of Escherichia coli (E. coli) an electrochemical bioassay based on the utilization of genetically modified bacteriophages (phages) was developed. A lytic T7 phage was engineered to overexpress alkaline phosphatase (ALP) fused to a cellulose-specific carbohydrate-binding module after the infection of viable E. coli cells within 30 min incubation. Before the electrochemical detection, the expressed ALP is concentrated out of the media, by its affinity tag, simply by filtration of the bacteria lysate through cellulose. The amount of immobilized ALP directly correlates to the original bacteria concentration and is utilized for the enzymatic conversion of a substrate and the following electrochemical detection of the generated product. The enzymatic substrates p aminophenyl phosphate (pAPP) and p-nitrophenyl phosphate (pNPP) were tested whereby pAPP outperformed pNPP for the electrochemical detection of the resulting product with screen-printed carbon electrodes. The enzymatic reaction was optimized with respect to pH, reaction time, reaction temperature, and substrate concentration resulting in a limit-of-detection of 1000 CFU/mL within just 2 h. The simplicity of the bioassay, its low cost, and its ruggedness against matrix interferences displays the potential for the application in various complex sample matrices especially in resource-limited areas. Hereby the sensitivity can be enhanced by the cultivation of the bacteria before phage infection or the processing of higher sample volumes or even further by a combination of both approaches.
Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) are usually detected by their beta-hemolytic activity with cultivation on a blood agar plate in laboratory diagnosis. Besides the requirement of trained personnel, the detection is time-consuming and limits the timely decision on the right medical treatment. Liposomes, as erythrocyte surrogates, were exploited for the detection of S. pyogenes by utilizing their beta-hemolytic activity. Liposomes, composed of phospholipids and cholesterol, are synthesized by the reverse-phase evaporation method and encapsulate electrochemical active potassium ferrocyanide. Hereby the liposome size was directly controlled with the applied membranes, with various pore sizes, at the extrusion. The detection principle relies on the lysis of the liposomes by exotoxins of S. pyogenes and the electrochemical detection of the released potassium ferrocyanide using LIG electrodes. After 7 h of cultivation, S. pyogenes was detected within 15 min. The limits of detection were 100 to 1000 CFU/mL whereby larger liposomes (hydrodynamic diameter 700 nm and 340 nm, respectively) were found to be slightly more sensitive compared to smaller liposomes (180 nm hydrodynamic diameter). Furthermore, the specificity of the detection for beta-hemolysis was verified with non-hemolytic E. coli and heat-inactivated S. pyogenes.
Translation of the abstract (German)
Der Zugang zu gesunden und nahrhaften Lebensmitteln ist zwingend erforderlich, um Leben zu erhalten und die Gesundheit zu fördern. Während direkte Folgen von kontaminierter Nahrung Krankheit und auch Todesfälle beinhalten, besteht auch eine Verbindung zwischen Lebensmittelsicherheit und Ernährung sowie der Ernährungssicherung. Hierbei unterstützt eine gesicherte Lebensmittelversorgung für ...
Translation of the abstract (German)
Der Zugang zu gesunden und nahrhaften Lebensmitteln ist zwingend erforderlich, um Leben zu erhalten und die Gesundheit zu fördern. Während direkte Folgen von kontaminierter Nahrung Krankheit und auch Todesfälle beinhalten, besteht auch eine Verbindung zwischen Lebensmittelsicherheit und Ernährung sowie der Ernährungssicherung. Hierbei unterstützt eine gesicherte Lebensmittelversorgung für nationale Wirtschaften, Handel und Tourismus. Moderne Herausforderungen in der Lebensmittelversorgung beinhalten eine steigende Weltbevölkerung, die zunehmende Globalisierung, den Klimawandel und die, sich zunehmend verschlechternde, Bodenqualität. Obwohl diese Änderungen jeden betreffen sind, insbesondere Entwicklungsländer von den Folgen fehlender Lebensmittelsicherheit, aufgrund fehlender Infrastruktur, teurer Laborausstattung und qualifiziertem Personal, betroffen. Biosensoren wurden als vielversprechende Werkzeuge identifiziert, um diese Herausforderungen zu meistern. Ihre Integrierbarkeit in portable Geräte ermöglicht die Überwachung von Lebensmitteln entlang der gesamten Lebensmittelkette. Die Fachgebiete Elektrochemie, Microfluidik und Biosensoren ergänzen sich hierbei. Insbesondere neue Elektrodenmaterialien und Nachweisstrategien sind hierbei der Schlüssel für die Entwicklung von hochsensitiven, verlässlichen und kostengünstigen Biosensoren.
Substratunabhängige laser-induced graphene Elektroden
Das 2014 entdeckte laser-induced graphene (LIG) kann direkt aus Polyimidfolien gewonnen werden. Aufgrund dieser einfachen Fabrikation ist LIG von besonderem Interesse, da es sich hierdurch von anderen Graphenmaterialien unterscheidet. Während die zunehmende Anzahl von Publikationen an elektrochemischen LIG-Sensoren dieses Interesse unterstreicht, ist die Integration von Polyimide in mikrofluidische Detektionssysteme erschwert durch seine Lösungsmittelbeständigkeit und thermische Stabilität. Zusätzlich zu bestehenden Transferstrategien wurde ein neues, auf Druck basierendes, Transferverfahren für den Transfer von LIG auf Thermoplaste entwickelt. Die morphologischen und elektrochemischen Eigenschaften des transferierten LIG (tLIG) wurden untersucht und mit LIG verglichen. Hierbei weist tLIG eine weniger poröse Oberfläche im Vergleich mit LIG auf. tLIG weist eine geringere aktive Elektrodenoberfläche, einen höheren Flächenwiderstand und geringfügig verringerte Elektrontransferraten auf. Zusätzlich bleibt der, für Graphen, charakteristische 2D -Peak im Ramanspektrum nicht während des Transfers erhalten. Trotz aller morphologischen Unterschieden sind die Ergebnisse in amperometrischen Messungen für beide LIG-Materialien vergleichbar für die Analyten p-Aminophenol, Hexaamineruthenium(III) und Kaliumhexacyanoferrat(II). Mittels doppelseitiger Klebebänder wurden mikrofluidische Chips, unter Verwendung von Polymethylmethacrylat (PMMA), hergestellt. Der Einfluss der Höhe des mikrofluidischen Kanals und der Fließgeschwindigkeit der Probenlösung wurde für die nachweisstarke Bestimmung von p Aminophenol, dem Reaktionsprodukt der enzymatischen Umsetzung von p-Aminophenolphosphat mittels alkaliner Phosphatase, optimiert. Alkaline Phosphatase ist zum einen ein häufig detektierter Biomarker und andererseits zur enzymatischen Signalverstärkung in der Biosensorik. In dem entwickelten mikrofluidischen System konnte alkaline Phosphatase mit einem Detektionslimit von 0.3 U/L, unter Verwendung von 40 µL Probelösung, detektiert werden.
Bakteriellen Nachweis durch Bioassays
Zur Bestimmung von Escherichia coli (E. coli) wurde ein elektrochemischer Bioassay unter der Verwendung von genetisch veränderten Bakteriophagen entwickelt. Eine lytische T7 Bakteriophage wurde gentechnisch verändert um alkaline Phosphatase (ALP), die ein für Zellulose spezifischen Kohlenhydrat-Bindungsmodul beinhaltet, zu exprimieren. Hierbei wird ALP innerhalb von 30 min nach der Infektion von vitalen E. coli Zellen freigesetzt. Der Affinitäts-Tag ermöglicht die einfache Anreicherung von ALP auf Zellulose durch Filtration des Mediums, nach Lyse der Bakterien, vor der elektrochemischen Bestimmung. Die Menge an immobilisierter ALP korreliert hierbei direkt mit der ursprünglichen E. coli Konzentration und wird für die enzymatische Umsetzung eines Enzymsubstrats und der folgenden elektrochemischen Detektion des Produkts verwendet. Hierzu wurden die Substrate p-Nitrophenolphosphat (pNPP) und p-Aminophenolphosphat (pAPP) getestet wobei pAPP eine nachweisstärkere Detektion mittels screen-printed carbon electrodes ermöglicht. Die enzymatische Reaktion wurde unter Einbeziehung von pH-Wert, Reaktionszeit, Reaktionstemperatur und Substratkonzentration optimiert, wodurch eine untere Nachweisgrenze von 1000 CFU/mL E. coli innerhalb von 2 h mit dem entwickelten Bioassay erreicht wurde. Die Einfachheit des Bioassays kombiniert mit geringen Kosten und die hohe Robustheit gegenüber störenden Matrixeffekten zeigt das Potential für zukünftige Anwendungen, insbesondere in Gebieten mit beschränkten Ressourcen. Durch die Kultivierung von Bakterien vor der Infektion mit Bakteriophagen oder die Filtration von größeren Volumina, sowie eine Kombination beider Strategien kann die Sensitivität der Detektion weiter verbessert werden.
In der Labordiagnostik wird zum Nachweis von Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), mittels Kultivierung auf Blutagar, deren Beta-Hämolyse genutzt. Neben der Notwendigkeit von qualifiziertem Personal ist diese Nachweismethode sehr zeitaufwändig und begrenzt die zeitige Einbeziehung der Ergebnisse für medizinische Behandlungen. Liposome, als Stellvertreter für Erythrozyten, wurden für den Nachweis von S. pyogenes, aufgrund ihrer Beta-Hämolyse, genutzt. Liposome, zusammengesetzt aus Phospholipiden und Cholesterol, wurden mittels Rückphasenverdampfung synthetisiert wobei elektrochemisch aktives Kaliumhexacyanoferrat(II) eingeschlossen wurde. Hierbei wurde die Größe der Liposome durch die Verwendung von Membranen mit unterschiedlichen Porengrößen, während der Extrusion, kontrolliert. Die Detektionsstrategie basiert auf der Lyse von Liposomen durch, von S. pyogenes produzierten, Exotoxine und der anschließenden elektrochemischen Bestimmung von freigesetztem Kaliumhexacyanoferrat(II) unter Verwendung von LIG Elektroden. Nach 7 h Kultivierung konnte S. pyogenes innerhalb von 15 min detektiert werden wobei untere Nachweisgrenzen von 100 CFU/mL bis 1000 CFU/mL erreicht wurden. Größere Liposome mit hydrodynamischen Durchmessern von 700 nm und 340 nm erwiesen sich hierbei ein wenig nachweisstärker im Vergleich zu Liposomen mit einem hydrodynamischen Durchmesser von 180 nm. Die Sensitivität des Nachweises von Beta-Hämolyse wurde anhand von nicht-hämolysierenden E. coli und hitzedeaktivierten S. pyogenes gezeigt.
Metadata last modified: 27 Jul 2022 04:22
Owner only: item control page
Download Statistics