| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (17MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-510309
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.51030
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 19 Oktober 2022 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Tag der Prüfung: | 19 Oktober 2021 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Stichwörter / Keywords: | Nisin, nicht-kanonische Aminosäuren, non-canonical amino acids, unnatural amino acids, nicht-natürliche Aminosäuren, Methionin, Substitution, Methioninsubstitution, leak expression, non-canonical start codons, lantibiotics, modification of nisin, amino acid substitution, nisin variant |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 51030 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Zu einer der größten Herausforderungen der modernen Medizin gehört die Entwicklung neuer antibiotischer Wirkstoffe, welche gegen eine wachsende Anzahl, zum Teil multiresistenter, pathogener Keime, wirken. Eine in diesem Zusammenhang vielversprechende Substanzklasse ist die der Lantibiotika. Dabei handelt es sich um ribosomal-synthetisierte Peptide, die zur Klasse I der Bacteriocine gehören und ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Zu einer der größten Herausforderungen der modernen Medizin gehört die Entwicklung neuer antibiotischer Wirkstoffe, welche gegen eine wachsende Anzahl, zum Teil multiresistenter, pathogener Keime, wirken. Eine in diesem Zusammenhang vielversprechende Substanzklasse ist die der Lantibiotika. Dabei handelt es sich um ribosomal-synthetisierte Peptide, die zur Klasse I der Bacteriocine gehören und eine breite antibiotische Wirksamkeit gegen Gram-positive Bakterien besitzen. Die Kombination aus verschiedenen antimikrobiellen Wirkmechanismen als auch die bisher kaum beobachtete Resistenzbildung macht Lantibiotika zu einem interessanten Forschungsgegenstand. Ihr prominentester Vertreter ist Nisin, ein in seiner maturen Form 34 Aminosäuren umfassendes, natürlicherweise in Lactococcus lactis synthetisiertes und post-translational modifiziertes Polypeptid. Zur Erweiterung des antimikrobiellen Spektrums von Nisin, sowie zur Anpassung seiner pharmakologischen Eigenschaften, ist die ko-translationale Inkorporation von nicht-kanonischen Aminosäuren (nkAS) eine sehr vielversprechende Möglichkeit.
In vorangegangenen Experimente unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass diese Inkorporation zwar prinzipiell möglich ist, jedoch abhängig von der ausgewählten Aminosäureposition der Einbau der nkAS lediglich mit einer sehr niedrigen Effizienz erfolgt. Zur relativen Quantifizierung der Einbaueffizienz von nkAS in Nisin wurde ein, in unserer Arbeitsgruppe entwickelter, auf einem Nisin-GFP-Fusionsprotein basierender Assay (im Folgenden „Suppressionseffizienzassay“ genannt) verwendet. Unabhängig von der Anwesenheit der nkAS konnte eine Proteinexpression beobachteten werden, obwohl bei Fehlen der nkAS theoretisch ein Translationsabbruch und somit keine Proteinexpression stattfinden sollte. Dieses Problem galt es, mit dem Ziel die Suppressionseffizienz zu verbessern, zu adressieren. Im Falle einer hohen (verbesserten) Suppressionseffizienz, würde man folglich keine Proteinexpression bei Fehlen der nkAS, beziehungsweise eine starke Expression bei Vorliegen der nkAS im Suppressionseffizienzassay beobachten. Wir postulierten die Entstehung von Nebenprodukten durch interne Ribosomen-Bindungsstellen innerhalb von Nisin als Ursache für die verminderte Suppressionseffizienz, welche zur Verbesserung der Einbaueffizienz von nkAS in Nisin zunächst vermindert bzw. unterdrückt werden sollte. Hierfür wurden zwei Lösungsansätze verfolgt: (i) Änderung der Gensequenz der postulierten internen Ribosomen-Bindungsstelle mit dem Ziel ihre Ribosomen-Bindungsstärke abzuschwächen, (ii) Ersatz der beiden Methionine (ATG) an Position 17 und 21 durch geeignete Codons anderer Aminosäuren, um ihre Funktion als interne Translationsstarter auszuschließen. Lösungsansatz (i) wurde über die Optimierung der natürlich vorkommenden Gensequenz („Codon-Optimierung“) von Nisin A für den Zielorganismus Escherichia coli mit Hilfe des GeneOptimzer Algorithmus (1) realisiert. Anschließend konnte mit Hilfe des RBS calculator (2) in silico die Verringerung der Bindungsstärke von jeder in der natürlichen Gensequenz existierenden internen ribosomalen Bindungsstellen gegen-über der Codon-optimierten Gensequenz gezeigt werden. Im Suppressionseffizienzassay zeigte sich jedoch keine wesentliche Verbesserung der Suppressionseffizienz im Vergleich zur Variante mit der natürlich Gensequenz. Für Lösungsansatz (ii) wurde auf Basis von publizierten Ergebnissen beschlossen das Methionin an Position 21 durch Lysin zu ersetzen, wodurch die antimikrobielle Aktivität von Nisin nicht vermindert wird. Für das Methionin an Position 17 lagen keine eindeutigen Daten vor, weshalb hier je eine Variante mit jeder der 19 verbleibenden natürlichen Aminosäuren kloniert wurde. Um sicher zu gehen, dass die entstandene Nisin-Varianten mit den zwei ausgetauschten Methioninen mit der besten antimikrobiellen Aktivität für die weiterführenden Suppressionseffizienzexperimente ausgewählt wird, wurden alle 19 Varianten in Lactococcus lactis exprimiert und mit Hilfe verschiedener Assays auf ihre Aktivität im Vergleich zum natürlich vorkommenden Nisin A untersucht. Nisin M17WM21K (Methionin an Position 17 zu Tryptophan und Methionin an Position 21 zu Lysin ausgetauscht) zeigte die stärkste antimikrobielle Aktivität und führte im anschließenden Suppressionseffzienzassay zu einer deutlichen Steigerung der Suppressionseffizienz. Durch eine Kombination aus Lösungsansatz (i) und (ii), also ein Codon-optimiertes M17WM21K Nisin, konnte dabei keine zusätzliche Steigerung der Suppressionseffizienz im Vergleich zum nicht-Codon-optimierten M17WM21K Nisin erzielt werden.
Weiterhin wurde im Rahmen der Arbeit ein heterologes Expressionssystem für Nisin in E. coli erfolgreich etabliert. Da E. coli der am besten studierte und meist genutzte Organismus für den Einbau von nkAS ist, bietet sich bei dessen Nutzung auch die vielfältigste und Bandbreite an biotechnologischen Werkzeugen. Zur Nisin-Expression wurden zunächst verschiedene E. coli-Stämme hinsichtlich ihrer Produktionsrate über Agar-Well-Diffusion-Assays relativ miteinander verglichen und anschließend wurde ein geeignetes Reinigungsprotokoll, bestehend aus einer Kombination von Metall-Affinitätschromatographie, Gelfiltration und Chromatographie durch hydrophobe Wechselwirkungen, für das post-translational modifizierte Nisin ausgearbeitet. Das so gewonnen Nisin konnte mit Hilfe eines antimikrobielle Aktivitätsassay, Massenspektrometrie sowie Peptide Mass Fingerprinting charakterisiert werden und über einen Minimal Inhibitory Dilution Assay die Ausbeute bestimmt werden. Zur zukünftigen Vereinfachungen der Nisin-Produktion in E. coli wurde ein erstes Set an orientierenden Experimenten zur Funktionalität des L. lactis eigenen Nisin-Transporters NisT in E. coli durchgeführt. Die Ergebnisse lassen die Funktionalität des Transporters in E. coli vermuten.
Im Zuge dieser Arbeit konnten Methionin-Codons (ATG) innerhalb der Gensequenz von Nisin als alternative Translationsinitiatoren, welche die Einbaueffizienz von nkAS vermindern, identifiziert werden und das Problem durch einen Austausch der Methionin-Codons mit alternativen Aminosäure-Codons weitgehend gelöst werden. Für zukünftige Arbeiten, die sich mit dem Einbau von nkAS in Methionin-haltige Peptide und Proteine beschäftigen, stellt diese Erkenntnis einen wichtigen Hinweis zur Vermeidung der Bildung von verkürzten Translationsprodukten dar. Darüberhinaus konnte die Expression von Nisin in E. coli in unserer Arbeitsgruppe erfolgreich etabliert werden, was weiterführenden Experimente zur Modifikation von Nisin mit nkAS den Weg ebnet.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
One of the greatest challenges facing modern medicine is the development of new antibiotic agents that are effective against a growing number of pathogens, some of which are multi-resistant. One promising substance class in this context is that of lantibiotics. Lantibiotics are ribosomal-synthesized peptides that belong to class I of the bacteriocins and have broad antibiotic activity against ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
One of the greatest challenges facing modern medicine is the development of new antibiotic agents that are effective against a growing number of pathogens, some of which are multi-resistant. One promising substance class in this context is that of lantibiotics. Lantibiotics are ribosomal-synthesized peptides that belong to class I of the bacteriocins and have broad antibiotic activity against Gram-positive bacteria. The combination of different antimicrobial mechanisms of action as well as the so far hardly observed development of resistance makes lantibiotics an interesting research topic. Their most prominent representative is nisin, a polypeptide comprising 34 amino acids in its mature form, naturally synthesized in Lactococcus lactis and post-translationally modified. To broaden the antimicrobial spectrum of nisin, as well as to tailor its pharmacological properties, co-translational incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is a very promising possibility.
In previous experiments of our group it could be shown that this incorporation is in principle possible, but depending on the selected amino acid position the incorporation of ncAAs is only performed with a very low efficiency. For the relative quantification of the incorporation efficiency of ncAAs into nisin, an assay based on a nisin-GFP fusion protein (hereafter referred to as "suppression efficiency assay") developed in our group was used. Protein expression was observed independent of the presence of ncAAs, although in the absence of ncAAs there should theoretically be translational arrest and thus no protein expression. This problem had to be addressed with the aim of improving suppression efficiency. In the case of high (improved) suppression efficiency, one would consequently observe no protein expression in the absence of ncAAs, or strong expression in the presence of ncAAs in the suppression efficiency assay. We postulated the generation of side products by internal ribosome binding sites within nisin as the cause of the reduced suppression efficiency, which should first be reduced or suppressed to improve the incorporation efficiency of ncAAs into nisin. To this end, two approaches were pursued: (i) modification of the gene sequence of the postulated internal ribosome binding site with the aim of attenuating its ribosome binding strength, (ii) replacement of the two methionines (ATG) at position 17 and 21 with suitable codons of other amino acids to exclude their function as internal translation starters. Solution (i) was realized by optimizing the naturally occurring gene sequence ("codon optimization") of nisin A for the target organism Escherichia coli using the GeneOptimzer algorithm (1). Subsequently, using the RBS calculator (2), the reduction of the binding strength of each internal ribosomal binding site existing in the natural gene sequence could be shown in silico compared to the codon-optimized gene sequence. However, in the suppression efficiency assay, there was no significant improvement in suppression efficiency compared to the variant with the natural gene sequence. For approach (ii), based on published results, it was decided to replace the methionine at position 21 with lysine, which does not reduce the antimicrobial activity of nisin. No clear data were available for the methionine at position 17, so a variant was cloned here with each of the 19 remaining natural amino acids. To ensure that the resulting nisin variant with the two exchanged methionines with the best antimicrobial activity would be selected for further suppression efficiency experiments, all 19 variants were expressed in Lactococcus lactis and tested for their activity compared to the naturally occurring nisin A using various assays. Nisin M17WM21K (methionine at position 17 exchanged to tryptophan and methionine at position 21 exchanged to lysine) showed the strongest antimicrobial activity and resulted in a significant increase in suppression efficacy in the subsequent suppression effciency assay. A combination of approach (i) and (ii), i.e. a codon-optimized M17WM21K nisin, did not lead to an additional increase in suppression efficiency compared to the non-codon-optimized M17WM21K nisin.
Furthermore, a heterologous expression system for nisin in E. coli was successfully established in the course of this work. Since E. coli is the best studied and most widely used organism for the incorporation of ncAAs, its use also offers the most diverse and wide range of biotechnological tools. For nisin expression, different E. coli strains were first relatively compared with respect to their production rate via agar well diffusion assays, and then a suitable purification protocol, consisting of a combination of metal affinity chromatography, gel filtration, and chromatography by hydrophobic interactions, was devised for the post-translationally modified nisin. The resulting nisin was characterized by antimicrobial activity assay, mass spectrometry, and peptide mass fingerprinting, and the yield was determined by a minimal inhibitory dilution assay. For future simplification of nisin production in E. coli, a first set of orienting experiments on the functionality of the L. lactis specific nisin transporter NisT in E. coli was performed. The results suggest the functionality of the transporter in E. coli.
In the course of this work, methionine codons (ATG) within the gene sequence of nisin were identified as alternative translation initiators that reduce the incorporation efficiency of ncAAs, and the problem was largely solved by replacing the methionine codons with alternative amino acid codons. For future work dealing with the incorporation of ncAAs into methionine-containing peptides and proteins, this finding represents an important clue to avoid the formation of truncated translation products. Furthermore, the expression of nisin in E. coli was successfully established in our group, which paves the way for further experiments on the modification of nisin with ncAAs.
Metadaten zuletzt geändert: 19 Okt 2022 06:40
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