Einfluss von Substanz P und α-Calcitonin gene-related peptide auf die Chondrogenese und Zellvitalität von humanen mesenchymalen Stammzellen

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-510507
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.51050

Wenig, Elisabeth

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License: Creative Commons Attribution 4.0
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Date of publication of this fulltext: 03 Dec 2021 11:08

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	3 December 2021
Referee:	Prof. Dr. Susanne Grässel
Date of exam:	17 November 2021
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Orthopädie
Keywords:	Substanz P, α-Calcitonin gene-related peptide, humane mesenchymale Stammzellen
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	51050

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Abstract (German)

Abstract (German)

Über die Ausschüttung von sensiblen Neurotransmittern wie Substanz P (SP) und α-Calcitonin gene-related peptide (αCGRP) kann das Nervensystem unter anderem die physiologischen und pathologischen Vorgänge im artikulären Knorpel modulieren.
Kommt es zu chondralen oder osteochondralen Läsionen des Knorpels, sind die mesenchymalen Stammzellen eine vielversprechende Quelle für eine Knorpelregeneration.
Wir konnten in dieser Arbeit zeigen, dass das sensible Nervensystem durch die Neurotransmitter SP und αCGRP in Abhängigkeit der Konzentration die chondrogene Differenzierung und die Zellvitalität von mesenchymalen Stammzellen beeinflusst.
In mesenchymalen Stammzellen wurde nach SP-Stimulation konzentrationsabhängig die Zellvitalität beeinflusst. Über eine gesteigerte Cyclin D1 Bildung und vermehrten Übergang in die S-Phase auf Zellzyklusebene förderte die geringe SP Konzentration (10-10 M) die Proliferation der undifferenzierten hMSC. Nach Stimulation der hMSC mit einer hohen SP Konzentration wurde kein Einfluss auf die Verteilung im Zellzyklus beobachtet.
Nach SP Stimulation (mit beiden Konzentrationen) wird BCL2 an Tag 21 verstärkt nachgewiesen. Da jedoch nach 10-10 M SP Stimulation BCL2 an Tag 28 vermindert exprimiert wurde, könnte also vermutet werden, dass SP in der frühen Phase der Differenzierung die hMSC vor Apoptose schützt und in der niedrigen Konzentration in der späten Differenzierungsphase die Apoptose fördert.
Beide SP-Konzentrationen förderten den Übergang der Zellen in einen hypertrophen Zustand, da bereits nach Tag 7 hypertrophe Marker wie Kollagen X (beide Konzentrationen) und VEGFα (10-10 M SP) hochreguliert wurden. Zugleich wurden die chondrogenen Prozesse möglicherweise durch die 10-8 M SP-Stimulation verlangsamt, da nach Tag 21 chondrogener Differenzierung weiterhin mesenchymale Stammzellmarker (COL1A1) nachweisbar waren und SOX9 und FGF2 vermindert exprimiert wurden. Die Stimulation mit 10-10 M SP förderte möglicherweise die Chondrogenese, da es nach Tag 14 chondrogener Differenzierung zur signifikanten Reduktion von COL1A1 kam und ausgewählte chondrogene Marker vermehrt exprimiert wurden. Allerdings ergaben der Kollagen-Typ II-ELISA, die Glykosaminoglykanproduktion oder die Aggrekanfärbung unserer Zellaggregate keine signifikanten Unterschiede zur unstimulierten Kontrolle.
Des Weiteren konnten wir zeigen, dass 10-10 M αCGRP die Expression ausgewählter kataboler Markergene inhibiert, während mit der höheren Konzentration (10-8 M) von αCGRP die Genexpression kataboler Zytokine induziert wurden, was als weitere Ursache der hemmenden Wirkung auf die Chondrogenese der hMSC gesehen werden kann. Stimulation mit 10-10 M αCGRP könnte pro-apoptotisch auf MSC während eines fortgeschrittenen chondrogenen Prozesses wirken, indem es die Genexpression von BCL2 hemmt. Bei Stimulation mit der niedrigen Konzentration von αCGRP zeigte sich eine gesteigerte Cyclin D1 Produktion, was positiv auf die Proliferationsaktivität der hMSC wirken könnte. Reduzierter GAG-Gehalt, später Anstieg der COL2A1 Expression und der fehlende Anstieg der COL10A1 Expression, machten den inhibierenden Einfluss der αCGRP Stimulation auf die Chondrogenese deutlich.
Die konzentrationsabhängigen Effekte könnten sich durch die Physiologie der G-Protein gekoppelten Neuropeptidrezeptoren erklären. Möglicherweise führen die unterschiedlichen Konzentrationen der Liganden zu intra- und extrazellulären Veränderungen, weshalb es zur Aktivierung unterschiedlicher G-Proteine kommt und so zu teils konträren Ergebnissen.
Wünschenswert, zur weiteren Untersuchung der Zellvitalität, wären Studien zur genaueren Analyse der Proteinbiochemie und zu möglichen αCGRP-/SP-abhängigen Signalwegen. Des Weiteren erscheint es sinnvoll die Rolle des αCGRP als Hemmfaktor der Chondrogenese im Hinblick auf klinische Therapieverfahren, die hMSC einsetzen, zu beachten.

Translation of the abstract (English)

The peripheral nervous system, especially, substance p (SP) and alpha calcitonin gene related peptide (CGRP) sensory nerve fibers are critically involved in physiological or pathological cartilage metabolism. Because of its limited healing capacity, treatments for articular injuries are important. Mesenchymal stem cell (MSC) based therapy has received considerable research attention.
Therefore, the aim of this work was to analyze the effects of SP and CGRP on the metabolism and chondrogenic potential of MSC.
SP in low concentration (10-10M) induced proliferation by increased cyclin d1 expression and promoted transition to s-phase in cell cycles. MSC could be protected from apoptosis by induced bcl2 expression in the early phase of chrondrogenic process, although this effect is lost in the late phase. Both SP concentrations induced hypertrophy markers (COL10A1, VEGFα) in the first 7 days of 3D-culture. Stimulation with high concentration of SP (10-8M) increased expression of COL3A1 and decreased SOX9 and FGF2 expression. However protein synthesis of collagen II and the glycosaminoglycan (GAG)-production remain unaffected. No differences in alcian blue staining between the stimulation groups and the unstimulated control were detected.
Stimulation with different concentrations (10-10M and 10-8M) of CGRP had contrary effects on catabolic marker-genes. Stimulation with the high concentration of CGRP induced interleukin 8 (IL8), tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 6 (IL6) expression, while treatment with the low concentration caused the opposite effect. Through inhibited bcl2 expression CGRP could have had a pro-apoptotic effect on MSC. The decreased biosynthesis of collagen type II, the reduced gag-content, and the missing increase in collagen type X expression all show an inhibitory effect after CGRP stimulation.
The neurokinin 1- (NK1R) and the CGRP-receptor belong to the G protein-coupled receptor family and different intracellular signaling pathways have been described. Depending on the specific G proteins different intracellular signaling pathways could be activated.

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