| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (4MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-513808
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.51380
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 1 Juli 2022 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Sascha Bandulik |
| Tag der Prüfung: | 17 Dezember 2021 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Physiologie Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Richard Warth |
| Stichwörter / Keywords: | Nebenniere; Aldosteron; Primärer Hyperaldosteronismus; CACNA1H; Calciumkanal; pH |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 51380 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Primärer Hyperaldosteronismus (PA) ist eine der häufigsten Grunderkrankungen, die zur Entstehung von Bluthochdruck führt. Kennzeichnend dabei ist die unkontrollierte Überproduktion des Mineralocorticoids Aldosteron in Zellen der Zona glomerulosa der Nebennierenrinde. Aldos¬teron aktiviert die Na+ Resorption und K+ Sekretion in der Niere und trägt somit entscheidend zur Regula-tion des Elektrolyt- ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Primärer Hyperaldosteronismus (PA) ist eine der häufigsten Grunderkrankungen, die zur Entstehung von Bluthochdruck führt. Kennzeichnend dabei ist die unkontrollierte Überproduktion des Mineralocorticoids Aldosteron in Zellen der Zona glomerulosa der Nebennierenrinde. Aldos¬teron aktiviert die Na+ Resorption und K+ Sekretion in der Niere und trägt somit entscheidend zur Regula-tion des Elektrolyt- und Wasserhaushalts bei. Physiologisch erfolgt die Stimulation der Aldosteronproduktion hauptsächlich durch eine erhöhte Plasmakaliumkonzentration und Angiotensin II (Ang II). Beides führt zu einer Depolarisation des Membranpotentials und infolgedessen zum Öffnen spannungs¬aktivierter Calciumkanäle. Dadurch kommt es zum Anstieg der intrazelluläre Ca2+ Konzentration, wodurch Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinasen (CaMK) aktiviert werden und es so letztendlich zu einer erhöhten Expression der Aldosteronsynthase (CYP11B2) kommt. Eine wichtige Rolle spielt hierbei der T Typ Calciumkanal CACNA1H (CaV3.2). Verschiedene Mutationen dieses Kanals konnten in den vergangenen Jahren auch bei PA Patienten gefunden wer-den. Neben Ca2+ spielen aber auch weitere Faktoren eine wichtige Rolle bei der Aldosteron¬synthese. Der intra¬zellulären pH Wert ist einer davon. Über welche Signalwege der pH Wert Einfluss auf die Aldos¬teronproduktion nimmt, ist bisher allerdings unklar.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu untersuchen, welche Auswirkung die CACNA1H-Mutation M1549V auf die Kanalfunktion im adrenalen Zellmodell hat. Dies soll zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie dieser Mutation bei der Entstehung von PA führen. Ein weiteres Ziel war, mögliche Signalwege zu entschlüsseln, über welche der intrazelluläre pH die Aldosteronsynthese reguliert.
Mittels Ganzzell Patch Clamp Messungen wurde gezeigt, dass in adrenalen NCI H295R-Zellen CACNA1HM1549V bei physiologischen Ionenkonzentrationen bereits bei stärker hyperpolarisiertem Membranpotential öffnet und somit im Bereich des Ruhemembranpotentials von nativen Glome-rulosazellen aktiv ist. Daneben entwickelten Zellen, welche die Mutante überexprimierten, deutliche Oszillationen des Membranpotentials. Weiterhin wurde gezeigt, dass die veränderten elektrophysio-logischen Eigenschaften von CACNA1HM1549V zu einer Störung der zellulären Ca2+ Homöostase füh-ren. Zusätzlich wurde die Bedeutung der extrazellulären Na+ Konzentration untersucht, da T Typ Calciumkanäle zu einem gewissen Grad auch Na+ permeabel sind. Die Ent¬fernung von Na+ aus der extrazellulären Lösung führte in Zellen mit mutiertem Kanal zu einer Reduktion des CACNA1H-Stroms, der Membranpotentialoszillationen und der intrazellulären Ca2+ Aktivität. Weiterhin wurde gezeigt, dass CACNA1HM1549V zu einer intra¬zellulären Ansäuerung führt, diese Veränderung des pH allerdings nicht ursächlich für die veränderte Ca2+ Aktivität unter Na+ freien Bedingungen ist. Die Versuche verdeutlichen somit die Bedeutung von CACNA1H für die Aldosteronsynthese. Gleichzeitig wird klar, wie CACNA1HM1549V zu einer stimulationsunabhängigen Aldos¬teronproduktion – und somit zum Krankheitsbild des PA – führen kann.
Um zu untersuchen, über welche Signalwege der intrazelluläre pH-Wert die Aldosteronproduktion beeinflusst, wurden Zellen mit Kalium oder Ang II und zusätzlich Natriumacetat (NaAc) stimuliert. Gleichzeitig wurden verschiedene Signalwege durch entsprechende Inhibitoren gehemmt. Zunächst zeigte sich, dass NaAc die Kalium- und Ang II-stimulierte Aldosteronproduktion verstärkt. Durch Hemmung von spannungsgesteuerten Calciumkanälen und CaMK wurde deutlich, dass dieser NaAc-Effekt teilweise Ca2+ vermittelt ist. Insbesondere bei Ang II Stimulation werden jedoch weitere pH abhängige Signalwege aktiviert. Eine Hemmung der Proteinkinase C (PKC) und der Proteinkina-se D (PKD) zeigte, dass vor allem die PKD in Ang II-stimulierten NCI Zellen für die Aldos¬teronsynthese wichtig ist und dieser Signalweg auch durch den pH Wert beeinflusst wird. Allerdings scheint die PKD die Aldosteronsynthese vornehmlich über StAR und CYP21A2 zu regulieren, während CYP11B2 dabei eine eher untergeordnete Rolle einnimmt. Des Weiteren wurde eine Proteom¬analyse durchgeführt, wobei unstimulierte und verschieden stimulierte Zellen miteinander verglichen wurden. Hiermit soll-ten weitere Proteine identifiziert werden, die bisher im Zusammenhang mit Aldos¬teron und dessen Regulation unbekannt waren und deren Expression auch durch NaAc beeinflusst wird. Die erhaltenen Kandidaten sollten jedoch in unabhängigen Experimenten nochmals bestätigt werden. Dazu wurden erste Vorversuche durchgeführt, die die Ergebnisse der Proteomanalyse nur teilweise bestätigen. Jedoch sind weitere Versuche nötig, um zu klären, über welche genauen Mechanismen der pH Wert die Aldosteronsynthese beeinflusst.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Primary hyperaldosteronism (PA) is one of the most common underlying diseases leading to hyper-tension. PA is characterized by an uncontrolled overproduction of the mineralocorticoid aldos¬terone in zona glomerulosa cells of the adrenal cortex. Aldosterone activates Na+ reabsorption and K+ secretion in the kidney and thus contributes decisively to the regulation of electrolyte and water balance. ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Primary hyperaldosteronism (PA) is one of the most common underlying diseases leading to hyper-tension. PA is characterized by an uncontrolled overproduction of the mineralocorticoid aldos¬terone in zona glomerulosa cells of the adrenal cortex. Aldosterone activates Na+ reabsorption and K+ secretion in the kidney and thus contributes decisively to the regulation of electrolyte and water balance. Physiologically, aldosterone production is mainly stimulated by increased plasma potassium concentration and angiotensin II (Ang II). Both lead to a depolarization of the membrane potential and therefore to the opening of voltage-dependent calcium channels. This results in an increase in intracellular Ca2+ concentration, which in turn activates Ca2+/calmodulin-dependent kinases (CaMK) and finally to an increased expression of aldosterone synthase (CYP11B2). The T type calcium chan-nel CACNA1H (CaV3.2) plays an important role during this process. In the past years, various muta-tions of this channel have been found in PA patients. Though, other factors besides Ca2+ also play an important role in aldosterone synthesis. One of them is the intracellular pH. However, the signaling pathways by which pH can affect aldosterone production remain still unclear.
One aim of the present study was to investigate the influence of the CACNA1H mutation M1549V on channel function in an adrenal cell model. This should lead to a better understanding of the pathophysi¬ology of this mutation in the development of PA. Another aim was to identify possible signaling pathways of intracellular pH regulating aldosterone synthesis.
Using whole cell patch clamp measurements, it was demonstrated that in adrenal NCI H295R cells, CACNA1HM1549V opens at a more hyperpolarized membrane potential in presence of physio¬logical ion concentrations. Thus, it is already active in the range of the resting membrane potential of native glomerulosa cells. In addition, cells overexpressing the mutant channel developed marked oscillations of the membrane potential. Furthermore, it was shown that the altered electrophysio-logical properties of CACNA1HM1549V lead to a disturbance of cellular Ca2+ homeostasis. Moreover, the importance of extracellular Na+ concentration was investigated because T-type calcium channels are also Na+ permeable to some extent. In cells transfected with the mutant channel, Na+ removal from extracellular solution resulted in reduction of CACNA1H current, membrane potential oscil¬lations, and intracellular Ca2+ activity. Furthermore, CACNA1HM1549V led to intra¬cellular acidification, but this change in pH was not causative for the altered Ca2+ activity under Na+ free conditions. These experiments highlight the importance of CACNA1H for aldosterone synthesis. Moreover, these experiments demonstrate how CACNA1HM1549V can lead to aldosterone production independent of stimulation - and thus to the clinical picture of PA.
To investigate the signaling pathways by which intracellular pH influences aldosterone production, cells were stimulated with either potassium or Ang II and sodium acetate (NaAc) at the same time. Additionally, different signaling pathways were blocked by appropriate inhibitors. First, NaAc was shown to enhance potassium- and Ang II-stimulated aldosterone production. Inhibition of voltage-gated calcium channels and CaMK revealed a partially Ca2+ mediated NaAc effect. However, other pH-dependent signaling pathways are activated, particularly with Ang II stimulation. Inhibition of protein kinase C (PKC) and protein kinase D (PKD) showed that especially PKD is important for aldosterone synthesis in Ang II-stimulated NCI cells and that this pathway is also affected by pH. PKD, however, seems to regulate aldosterone synthesis primarily via StAR and CYP21A2, whereas CYP11B2 plays a rather subordinate role. Additionally, a proteomic analysis was performed comparing unstimulated and differently stimulated cells. The goal was to identify further proteins that were previously unknown in the context of aldosterone and its regulation and whose expression is also affected by NaAc. Nevertheless, the candidates obtained still had to be confirmed in independent experiments. For this purpose, preliminary experiments were performed, which par-tially confirmed the results of the proteomic analysis. However, further experiments need to be done to reveal the exact mechanisms by which pH affects aldosterone synthesis.
Metadaten zuletzt geändert: 01 Jul 2022 06:20
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