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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-518664
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.51866
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 9 Januar 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Marina Kreutz |
| Tag der Prüfung: | 14 Februar 2022 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Stichwörter / Keywords: | T Zellen, Metabolismus, LDHB, Tumorglykolyse, Warburg Effekt |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 51866 |
Zusammenfassung (Englisch)
In the 21st century, cancer has become the second leading cause of death worldwide. Novel therapeutic approaches do not only focus on limiting tumor growth or inducing tumor cell death but also include advanced immunotherapeutic approaches. One of the most promising strategies in arming the immune system against tumor diseases are redirected T cells. In 2012, a girl suffering from acute ...
Zusammenfassung (Englisch)
In the 21st century, cancer has become the second leading cause of death worldwide. Novel therapeutic approaches do not only focus on limiting tumor growth or inducing tumor cell death but also include advanced immunotherapeutic approaches. One of the most promising strategies in arming the immune system against tumor diseases are redirected T cells. In 2012, a girl suffering from acute lymphoblastic leukemia was the first patient cured with CAR T cells, which were genetically modified to recognize leukemia cells. In 2017, the first CAR T cell therapy was approved by the federal drug administration. Unfortunately, CAR T cell therapy is to date limited to the treatment of hematological cancer entities and often fails in solid tumors.
The tumor microenvironment has been established as part of the immune evasion machinery of tumor cells in the past decades. It is characterized by low levels of nutrients and high levels of suppressive tumor metabolites negatively affecting the infiltrating immune cells. This directly connects the microenvironment within solid tumors to T cell therapy failure: No matter how specific a T cell is, if it is not able to withstand the suppressive conditions within the tumor environment, it cannot mediate an anti-tumor response. Therefore, finding ways how to increase T cell resistance in the tumor microenvironment is a prerequisite for the development of adoptive T cell transfer therapies (ACTs) for solid tumors.
Lactate is produced by glycolytic tumor cells and exported together with protons, leading to lactate and proton accumulation in the tumor environment. Lactic acid negatively affects survival and effector functions of T cells and NK cells and was found to block T cell metabolism. Decreasing lactate secretion by genetic interference or pharmacological inhibition of lactate transport has demonstrated substantial benefits for the anti-tumor immunity. Thus, in this thesis, different metabolic, pharmacologic and genetic manipulations were investigated in order to increase the resistance of CD4 T cells towards lactic acid.
Lactic acid severely inhibited effector cytokine secretion and proliferation of CD4 T cells and induced apoptosis in higher concentrations. Moreover, lactic acid treatment blocked mitochondrial respiration, inhibited glucose uptake and prevented LDH isoenzyme shift, establishing a link between dampened T cell metabolic activity and effector functions. Buffering of the environmental pH mitigated the lactic acid effects in terms of viability, metabolic inhibition and cytokine secretion, underlining the high pH-dependency of lactic acid meditated inhibition.
One way to increase the lactic acid resistance of T cells could be to modify the culture conditions before adoptive transfer. We hypothesized that glucose limitation would prime the T cells towards a more oxidative metabolism, thereby mitigating the lactic acid impact. Indeed, glucose restricted T cells engaged their cellular respiration. However, glucose restriction did not increase lactic acid resistance of CD4 T cells in our hands.
Pharmacologically, glycolytic inhibition would be an alternative way to increase the mitochondrial respiration of T cells. We compared the influence of two different LDH inhibitors (R-(+)-GNE-140 (GNE) and NCI-737) on T cells. Treatment with NCI-737 led to a more distinct reduction in lactate secretion compared to GNE, but GNE acted stronger in terms of respiratory increase. However, LDH inhibition failed to rescue T cell metabolism upon high dose lactic acid treatment.
Besides modulating culture conditions or pharmacological intervention, genetic modification of T cells offers a way to alter their cellular metabolism.
A key enzyme in lactate metabolism is the lactate dehydrogenase. The adult enzyme is formed by two subunits, LDHA and LDHB, which form homo- and heterodimers and thereby build five isoenzymes. Due to different subset affinities, LDHA is considered to produce, LDHB to consume lactate. Therefore, we hypothesized that by manipulating the balance between LDHA and LDHB we could increase the lactate metabolization of T cells and thereby increase their lactic acid resistance.
In a first attempt, we downregulated LDHA by transfection of T cells with a LDHA-targeted siRNA. This led to a strong downregulation of LDHA for up to 48 h after activation. Surprisingly, LDHA downregulation did not affect lactate secretion or cellular respiration. Moreover, cytokine secretion was not influenced by lack of LDHA. However, the electroporation process was harmful for T cells, as reflected by decreased oxygen consumption and cytokine secretion, and did not increase cytokine secretion or T cell metabolic activity upon lactic acid treatment.
Second, we manipulated the LDH isoenzyme balance by stable overexpression of LDHB through retroviral gene delivery. LDHB overexpression led to a distinct shift in the LDH isoenzyme pattern of T cells. The altered LDH isoenzyme balance did not affect the differentiation or glucose usage of T cells, yet a slight increase in the basic respiratory activity at equal mitochondrial content was observed. Treating T cells with lactic acid, we found an increased cellular respiration and higher cytokine expression upon lactic acid treatment of the LDHB overexpressing cells. Most importantly, a spheroid co-culture experiment revealed higher cytotoxicity and better infiltration of LDHBhigh T cells.
Surprisingly, when we tried Ldhb overexpression in murine T cells for in vivo studies, we could not observe any effects of Ldhb on T cell metabolism and function. Following, we directly compared the mitochondrial and glycolytic metabolism of murine and human T cells and found pronounced differences regarding respiratory activity. Summarized, human T cells showed much higher respiratory activity and respiratory capacity than murine T cells regardless whether CD4 or CD8 T cells were analyzed. The most obvious difference was observed in the composition of the LDH isoenzymes, which was LDHA based in murine T cells but showed a much more balanced pattern in human T cells.
Lastly, we sought for additional ways to equip T cells with a higher resistance towards lactic acid. Therefore, we tried to learn from cells with the ability to resist high concentrations of lactic acid.
We found that macrophages were able to survive high lactic acid concentrations. With regards to the role of acidity in mediating the lactic acid effects, in first instance we analyzed the expression of key pH regulators in T cells, monocytes, macrophages and Treg. Overall, pH regulators were to a much higher level expressed in macrophages and monocytes compared to T cells, matching the hypothesis of pH regulation being crucial for lactic acid resistance. By applying selective inhibitors, we tried to further elucidate the roles of the different pH regulatory molecules in mediating lactic acid resistance. The obtained results were largely heterogenous, indicating a highly donor dependent and cooperative mechanisms causing better viability upon lactic acid treatment. Only diclofenac and aspirin, both COX inhibitors, induced macrophage dead in combination with lactic acid. However, the COX inhibitor ketoprofen failed to sensitize macrophages towards lactic acid, suggesting a mechanism beyond pH regulation and COX inhibition is responsible the survival ability of macrophages upon lactic acid treatment.
Not only macrophages are more resistant to lactic acid treatment, also within a T cell culture one can find T cells with a higher resistance towards lactic acid.
We wanted to investigate, whether different memory subsets display differential sensitivity towards lactic acid. Therefore, we sorted CD4 T cells in naïve, central memory and effector memory T cells and investigated their reaction on lactic acid treatment. Although slight differences regarding the cellular metabolism, the preservation of cytokine production and viability were observed, no T cell subset displayed a distinctly higher lactic acid resistance.
A CFSE analysis revealed within one bulk T cell culture, that some cells were able to partially preserve their proliferative capacity despite lactic acid treatment. We flow cytometrically sorted for proliferating T cells with and without lactic acid and performed an RNAseq analysis. Within the genes upregulated by lactic acid treatment, we found several genes known to be predominantly expressed by myeloid cells, which was as well reflected in a pathway analysis. Therefore, learning from myeloid cells seems a promising approach for further T cell manipulation.
In this thesis, genetic manipulation of T cells to overexpress the lactate metabolizing enzyme LDHB increased their cytokine secretion and enhanced their functionality in a spheroid co-culture approach. Analyzing macrophages as lactic acid resistant cells opened additional possibilities for further T cell manipulation with regards to pH regulation. However, the metabolic comparison of murine and human T cells revealed major differences, questioning the reliability of syngeneic mouse models when working with immunometabolic approaches.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Krebserkrankungen sind im 21. Jahrhundert die zweithäufigste Todesursache weltweit. Neu entwickelte Therapieverfahren konzentrieren sich mittlerweile jedoch nicht mehr ausschließlich darauf, das Tumorwachstum zu inhibieren oder Tumorzellen abzutöten, sondern beziehen das Immunsystem als Ziel und Mittel möglicher Therapien mit ein. Besonders vielversprechend ist dabei die Verwendung von spezifisch ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Krebserkrankungen sind im 21. Jahrhundert die zweithäufigste Todesursache weltweit. Neu entwickelte Therapieverfahren konzentrieren sich mittlerweile jedoch nicht mehr ausschließlich darauf, das Tumorwachstum zu inhibieren oder Tumorzellen abzutöten, sondern beziehen das Immunsystem als Ziel und Mittel möglicher Therapien mit ein. Besonders vielversprechend ist dabei die Verwendung von spezifisch umprogrammierten T Zellen, welche speziell Tumorzellen erkennen und bekämpfen sollen. Im Jahre 2012 wurde erstmalig eine junge Patientin, welche an akuter lymphoblastischer Leukämie litt, unter Verwendung von sogenannten CAR T Zellen geheilt. Diese T Zellen wurden umprogrammiert, um speziell Leukämiezellen zu erkennen. Im Jahr 2017 wurde die erste CAR T Zell basierte Therapie in den USA zugelassen. Jedoch ist die CAR T Zell Therapie bislang auf die Behandlung hämatologischer Krebserkrankungen beschränkt und zeigt bei soliden Tumoren eine deutlich schlechtere Wirkung.
Ein Grund für das Versagen von T Zell Therapien bei soliden Tumoren könnte im Mikromilieu von Tumoren zu finden sein, welches in den vergangenen Jahren als Teil der Immunevasion von Tumoren beschrieben wurde. Es ist charakterisiert durch Depletion von Nährstoffen einerseits und der Akkumulation von inhibierenden Tumormetaboliten andererseits, welche einwandernde Immunzellen negativ beeinflussen. Dies bringt das Tumormilieu direkt mit dem Versagen von T Zell Therapien in Verbindung: Selbst die spezifischste T Zelle kann keine solide anti-Tumor Antwort aufbauen, wenn Sie durch die vorherrschenden Konditionen zu stark negativ beeinflusst wird. Daher ist es für die Weiterentwicklung von T Zell Therapeutika essentiell, Wege zu finden, um die Resistenz von T Zellen gegenüber den Konditionen in der Tumorumgebung zu stärken.
Laktat wird in großer Menge von glykolytischen Tumorzellen produziert und zusammen mit Protonen in die Tumorumgebung sezerniert, wo es als Milchsäure akkumuliert. Milchsäure inhibiert die Effektorfunktionen verschiedener Immunzellen, stört deren zellulären Stoffwechsel und führt darüber hinaus in höheren Konzentrationen zum Zelltod. Durch die Reduktion der Laktatsekretion von Tumorzellen konnte bereits die Immunantwort gegen solide Tumoren deutlich verbessert werden. Daher sollten in der vorliegenden Arbeit pharmakologische, metabolische und genetische Manipulationen von T Zellen untersucht werden hinsichtlich der Fragestellung, ob die Resistenz der Zellen gegenüber Milchsäure dadurch gestärkt werden kann.
Milchsäure beeinträchtigte sowohl die Proliferation als auch die Sekretion von Effektorzytokinen von CD4 T Zellen und induzierte bei höheren Konzentrationen Apoptose. Darüber hinaus wurde unter Behandlung mit Milchsäure eine Blockade der Zellatmung sowie der LDH Isoenzym-Regulierung und reduzierte Glukoseaufnahme festgestellt, was eine direkte Verbindung des gestörten T Zell Metabolismus und inhibierter Effektorfunktionen nahelegt. Durch Puffern des extrazellulären pHs konnte der Effekt von Milchsäure abgeschwächt werden, was die pH-Abhängigkeit dieses Effekts unterstreicht.
Ein Weg, die Milchsäureresistenz von T Zellen zu erhöhen könnte die Modifikation der Kulturbedingungen vor adoptivem Transfer sein. Wir vermuteten, dass die Kultur von T Zellen unter Glukoserestriktion deren oxidativen Zellmetabolismus verstärken und dabei den Einfluss der Milchsäure reduzieren würde, was jedoch nicht der Fall war.
Ein pharmakologischer Weg, die Zellatmung von T Zellen zu erhöhen, könnte glykolytische Inhibition über Hemmung der Laktatdehydrogenase darstellen. Daher wurde die Wirkung zweier LDH-Inhibitoren (R-(+)-GNE-140 (GNE) und NCI-737) auf T Zellen verglichen. Die Behandlung mit NCI-737 führe zu einer deutlicheren Laktatreduktion, jedoch konnte unter GNE-Behandlung eine bessere Verstärkung der Zellatmung beobachtet werden. Unabhängig davon konnte durch Behandlung mit NCI-737 keine verbesserte Milchsäure-Resistenz erreicht werden.
Neben metabolischen und pharmakologischen Ansatzpunkten biete genetische Modifikation die Möglichkeit, den Metabolismus von T Zellen direkt zu beeinflussen.
Ein Schlüsselenzym im Laktatstoffwechsel ist die Laktatdehydrogenase (LDH), welche in adulten Zellen von den Untereinheiten LDHA und LDHB zusammengesetzt wird. Da diese Untereinheiten verschiedene Substrat-Spezifitäten aufweisen, wird vermutet, dass LDHA eher Laktat produziert, während LDHB eher Laktat verstoffwechselt. Daher versuchten wir, durch Manipulation der Balance zwischen den Isoenzymen die Verstoffwechselung von Laktat in T Zellen zu verstärken und dadurch die Milchsäure-Resistenz zu erhöhen.
In einem ersten Ansatzunkt wurde LDHA durch Elektroporation von T Zellen mit LDHA-spezifischer siRNA reduziert. Dies führte zu einer stark erniedrigten LDHA-Expression bis zu 48 h nach Aktivierung. Zu unserer Überraschung beeinflusste das Fehlen von LDHA die weder die Laktat- noch die Zytokinsekretion. Allerdings konnte durch die Elektroporation eine starke Beeinträchtigung der Zellatmung und der Zytokinsekretion beobachtet werden, und eine Verbesserung der Zellfunktionen unter Milchsäure blieb aus.
In einem weiteren Ansatz versuchten wir, die LDH Isoenzym Balance durch Überexpression von LDHB in T Zellen zu manipulieren. Dies führte zu einer sichtbaren Verschiebung im LDH Isoenzym Muster der Zellen. Überexpression von LDHB hatte keinen Einfluss auf die Differenzierung oder den Glukosemetabolismus der Zellen, obwohl eine leichte Verstärkung der Zellatmung bei unverändertem Mitochondriengehalt feststellbar war. Unter Behandlung mit Milchsäure zeigten die LDHB überexprimierenden Zellen eine verstärkte Zellatmung und eine verbesserte Zytokinproduktion. In einer Co-Kultur mit Tumor-Sphäroiden zeigten die LDHB überexprimierenden Zellen eine verstärkte Infiltration und bessere Zytotoxizität. Dies unterstreicht das Potential von LDHB überexprimierenden T Zellen in der Tumorbehandlung.
Überraschenderweise konnten die Ergebnisse der LDHB überexprimierenden T Zellen nicht von humanen in murine T Zellen übertragen werden. Daher verglichen wir den Glukose- und mitochondrialen Stoffwechsel von murinen und humanen T Zellen. Dabei stellten wir große Unterschiede in den Stoffwechselaktivitäten der verschiedenen T Zellen fest. Humane T Zellen zeigten eine wesentlich höhere respiratorische Aktivität und Kapazität als murine T Zellen. Am deutlichsten wurde der Unterschied im LDH Isoenzym Profil festgestellt. In murinen T Zellen wurde hauptsächlich die Expression von LDHA mit nur einem geringen Anteil LDHB festgestellt. Dagegen wurde in unstimulierten humanen T Zellen ein LDHB zentriertes Muster gefunden, welches sich unter Stimulation in Richtung LDHA verschob, es wurden jedoch weiter alle LDH Isoenzyme exprimiert.
Um weitere Möglichkeiten zu finden, die Resistenz von T Zellen gegenüber Milchsäure zu erhöhen, wurden Zellen mit einer bestehenden Milchsäureresistenz näher analysiert.
Wir konnten zeigen, dass Makrophagen in der Lage sind, sehr hohe Konzentrationen Milchsäure zu überleben. Mit Bezug zu der Rolle des niedrigen pHs bei der Vermittlung der Inhibition durch Milchsäure wurde in einem ersten Schritt die Expression verschiedener pH regulatorischer Proteine in Makrophagen, Monozyten und T Zellen analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass Makrophagen und Monozyten eine höhere Expression dieser pH Regulatoren zeigten. Dies stimmte mit der Vermutung, dass pH Regulation für das Überleben dieser Zellen in Umgebungen mit hohen Konzentrationen Milchsäure essenziell ist, überein. Durch die Verwendung spezifischer Inhibitoren haben wir versucht, die Rolle der verschiedenen pH Regulatoren präziser zu definieren. Die Ergebnisse diesbezüglich waren sehr heterogen und variierten zwischen verschiedenen Spendern, was einen kooperativen Mechanismus, in dem verschiedene pH Regulatoren zur Kompensation der Milchsäure-induzierten Ansäuerung zusammenarbeiten, nahelegt. Lediglich die COX-Inhibitoren Diclofenac und Aspirin induzierten den Zelltod von Makrophagen unter Behandlung mit Milchsäure. Dies legt nahe, dass es einen Mechanismus außerhalb der pH Regulation gibt, der das Überleben von Makrophagen unter Milchsäurebehandlung sichert.
Neben Makrophagen gibt es auch innerhalb einer T Zell Population Zellen, die eine höhere Resistenz gegenüber Milchsäure zeigen.
In einem ersten Schritt untersuchten wir, ob eine der verschiedenen Gedächtnis-Zell-Populationen eine höhere Resistenz gegenüber Milchsäure aufwies. Wir nutzten Durchflusszytometrie, um naive, Central memory und Effector memory Zellen zu sortieren und untersuchten deren Reaktionen auf Milchsäure. Obwohl es bezüglich der Atmungsaktivität, Zytokinproduktion und Überleben der Zellen leichte Unterschiede festgestellt wurden, konnte bei keiner der untersuchten Populationen eine erhöhte Milchsäure-Resistenz festgestellt werden.
Unter der Verwendung von CFSE konnten wir feststellen, dass innerhalb einer T Zell Kultur einige Zellen in der Lage waren, ihre Proliferation trotz Behandlung mit Milchsäure zumindest partiell zu erhalten. Wir nutzten CFSE, um proliferierende und nicht proliferierende T Zellen nach Milchsäurebehandlung durchflusszytometrisch zu sortieren und führten eine RNAseq Analyse durch. In den Genen, die durch Milchsäurebehandlung in proliferierenden Zellen induziert wurden, konnte eine Anreicherung der Gensignatur von CD14+ Monozyten festgestellt werden. Dies schlägt eine Brücke zu unserem Versuch, von Makrophagen zu lernen, welche genetische Modifikationen T Zellen zu einer verbesserten Milchsäureresistenz verhelfen könnte.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass genetische Manipulation von T Zellen zur Überexpression von LDHB die Zytokinsekretion dieser Zellen und deren Funktionalität in einer Spheroid Co-Kultur verbessert. Die Analyse von Makrophagen als milchsäureresistente Zellen eröffnete weitere Manipulationsmöglichkeiten der T Zellen zu Verbesserung der Milchsäureresistenz. Jedoch konnte gezeigt werden, dass der murine und humane T Zell Metabolismus substanziell verschieden sind, was die Zuverlässigkeit von syngenen Mausmodellen bei der Untersuchung immunometabolischer Konzepte in Frage stellt.
Metadaten zuletzt geändert: 10 Jan 2023 07:10
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