| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-523138
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.52313
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 23 May 2023 |
| Referee: | Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Date of exam: | 5 May 2022 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | hydrogel, anhydrous, therapeutic proteins, controlled release, protein delivery system, in situ gelation, biodegradation, Diels-Alder reaction, inverse electron demand Diels-Alder reaction, tunable reaction kinetics, cross-linking reaction, multi-armed poly(ethylene glycol) |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 52313 |
Abstract (English)
Since the first mention of the term hydrogel in 1960, a lot of work has been put into research and development of this polymeric material. While the high versatility makes many different applications possible, the use as transport vehicle is particularly promising. The reason for this is the well-defined architecture of the three-dimensional structure that creates cavities, in which cargo can be ...
Abstract (English)
Since the first mention of the term hydrogel in 1960, a lot of work has been put into research and development of this polymeric material. While the high versatility makes many different applications possible, the use as transport vehicle is particularly promising. The reason for this is the well-defined architecture of the three-dimensional structure that creates cavities, in which cargo can be embedded. After contact with an aqueous solution, hydrogels deliver the cargo with release kinetics depending on diffusion, degradation, or swelling. Used in the human organism, hydrogels can release encapsulated drugs to treat various diseases. Thereby, an extension of release time is primarily achieved via chemically cross-linked hydrogels due to their increased stability. For example, the monoclonal antibody bevacizumab embedded in chemically cross-linked hydrogels could be released in a controlled manner for the treatment of age-related macular degeneration over 100 days. Such a drug depot would be ideal to avoid repeated antibody injections associated with high personnel costs and reduced patient compliance.
However, delivery of proteins by using chemically cross-linked hydrogels still has its limitations (Chapter 1). Off-target reactions between proteins and the functional groups of the hydrogel precursors can cause delay of release, activity changes of the protein, and even immunogenic reactions. In addition, the number of embedded proteins is limited. Usually, a loading capacity of below 1% (w/v) is common. The reason for these drawbacks is the use of water, which also poses a threat to the stability of hydrolysis-prone hydrogel precursors.
The goal of this thesis was to develop chemically cross-linked hydrogels for the extended release of proteins that circumvents the limitations caused by water and other solvents. For this, the polymerization had to be carried out in an anhydrous environment to obtain polymers that swell to hydrogels after absorption of water. Due to the definition that hydrogels are hydrophilic polymeric networks that are produced by any technique able to trigger polymeric cross-linking, these polymers can be considered anhydrous hydrogels.
To check if solvent-free cross-linking can be used to prepare hydrogels, furan- and maleimide-functionalized eight-armed poly(ethylene glycol) (PEG) macromonomers were homogeneously mixed. After heating above the melting point, rheology revealed polymerization in molten state. In addition, decreasing the molecular weight of the macromonomers resulted in lower melting points favorable for the embedding of thermolabile proteins. The absence of water prevented not only the hydrolysis of water-sensitive maleimide groups but also off-target reactions between maleimide and nucleophilic amine residues of proteins. In this way, proteins could be embedded unmodified in a denser hydrogel network. Incubation of these polymers in an aqueous solution showed a water uptake up to 35-fold of the polymer mass. Thereby, stability varied between 54 and 150 days depending on the molecular weight of the macromonomers. Additionally, the complete release of the low molecular weight protein lysozyme within 10 days without activity loss showed no interaction between protein and unreacted polymer moieties after incubation in an aqueous environment. Finally, the model protein glucose oxidase (GOx), whose molecular weight and hydrodynamic diameter are similar to common antibodies, was released from anhydrous hydrogels over 100 days in biphasic behavior. Increasing the loading level from 5 to 15% (w/w) did not impact the release kinetics. Moreover, neither modification nor fragmentation were detected for the released protein, indicating the protective nature of these anhydrous protein depots (Chapter 3).
Despite prevention of off-target reactions and functional group hydrolysis and achieving protein release in a controlled manner, immediate anhydrous gelation in the organism is not possible with the Diels-Alder (DA) reaction between furan and maleimide. Therefore, the fast-proceeding inverse electron Diels-Alder (iEDDA) reaction between norbornene and tetrazine was introduced, which was not used to prepare hydrogels for the long-term release of proteins thus far. Besides the fast reaction rate, this reaction is bioorthogonal in an aqueous environment. Before the preparation of anhydrous hydrogels, conventional hydrogels were prepared to study the potential of the iEDDA reaction in combination with multi-armed PEGs. Aqueous mixtures of norbornene- and tetrazine-modified eight-armed PEGs showed gelation times below 1 min, complicating the injection due to premature gel formation. To facilitate handling, variations in polymer concentration, temperature, and chemical structure were applied. Additionally, a denser hydrogel network achieved by using a higher polymer concentration or smaller macromonomers resulted in increased mechanical properties. Then, lysozyme was used to examine off-target reactions in an aqueous environment. Modifications of only 11% of the model protein indicated the superiority of the iEDDA reaction over the DA reaction regarding unwanted side reactions. By incubation in 50 mM phosphate buffer (pH 7.4), hydrogel stability was found to be in the range of 186 and 530 days, depending on polymer concentration and molecular weight of the hydrogel precursors used. To assess the suitability of multi-armed PEG-hydrogels cross-linked via the iEDDA reaction for the application as a high molecular weight protein delivery system, GOx was embedded. The controlled in vitro release over more than 265 days proved the 15% (w/v) eight-armed PEG-hydrogels as highly promising injectable long-term protein delivery system (Chapter 4).
Although an extended release was achieved over more than 265 days, this long timeframe represents an obstacle regarding protein stability. For example, activity maintenance is not guaranteed for therapeutic proteins stored at 37 °C for a long time. In addition, the material residues would remain in the organism beyond therapy time due to slow degrading ester groups. Therefore, hydrogels with an adjustable degradation time would be favorable. To this end, 3,6-epoxy-1,2,3,6-tetrahydrophthalimide (ETPI), carbamate, carbonate ester, and phenyl carbonate ester were introduced as hydrolyzable linkers into the PEG-norbornene precursor. First of all, the impact of the linkers on the in situ gelation was studied. Gel points of less than 20 s even at a low polymer concentration of 5% (w/v) for all hydrogels revealed immediate gelation. Additionally, the effect of the linkers on the mechanical properties was analyzed by rheology and compressive testing. The ETPI linker resulted in the highest hydrogel stiffness due to the formation of an increased number of cross-links, determined by NMR spectroscopy. In contrast, the reduced stability of the phenyl carbonate ester linker led to hydrogels with the lowest mechanical properties. Since hydrogel precursor syntheses required toxic starting material, the hydrogel variants were examined considering cytocompatibility. All hydrogels passed the cytotoxicity assessment. Due to the goal of this chapter that was to shorten the erosion time of eight-armed PEG-hydrogels cross-linked via iEDDA reaction, the stabilities of 5% (w/v) hydrogels with different hydrolyzable linkers were determined. All hydrogels were stable at least 400 days except hydrogels containing the phenyl carbonate linkers, which showed complete erosion after 153 days. An increase in polymer concentration led to higher stability over more than 300 days for this hydrogel type, showing the potential of tuning the erosion time. The mesh sizes of the different hydrogels were found to be in the range of comparable hydrogels prepared with eight-armed PEGs, which were successfully used for protein delivery. In the final experiment, the release from all hydrogels was analyzed. A controlled release of 150 kDa fluorescein isothiocyanate-dextran over at least 150 days was achieved for all hydrogels (Chapter 5).
The iEDDA reaction was successfully introduced for the preparation of in situ forming delivery systems with varying degradation times. However, these drug depots were water-based, and off-target reactions, loading capacity, and functional group stability still limited the use of these hydrogels. To overcome these drawbacks and to achieve the goal of the thesis, the acquired knowledge regarding anhydrous hydrogel preparation, in situ gelation by using the iEDDA reaction, and tuning of erosion time was transferred to four-armed PEG macromonomers with a molecular weight of 2 kDa that are liquid at the operating temperature below 37 °C. For this, the macromonomers were functionalized with norbornene and tetrazine. Mixing of both precursors led to the formation of polymers, for which the iEDDA reaction was confirmed as cross-linking reaction by FTIR and UV-VIS spectroscopy. To prove the ability of in situ gelation, the liquid macromonomers were mixed and gelation time was determined. The polymers showed rapid gelation with gel points below 11 s. Chemical modification of norbornene and tetrazine groups led to changes in gelation time, stiffness, and three-dimensional structure. Despite the incorporation of various hydrolyzable groups, the polymers showed high stability of at least 200 days. In the final experiment, the suitability of this system for the delivery of proteins was investigated. For this, the protein GOx was embedded. The polymers were able to release the protein over a time of more than 475 days in a controlled manner, indicating the high potential of this polymeric material (Chapter 6).
Translation of the abstract (German)
Seit der ersten Erwähnung von Hydrogelen 1960 waren diese im Fokus zahlreicher Studien und wurden im Zuge der Forschung stetig weiterentwickelt. Auf Grund ihrer Vielseitigkeit ermöglichen Hydrogele eine Reihe unterschiedlicher Anwendungen, wobei besonders der Einsatz als Transportvehikel einen vielversprechenden Ansatz bietet. Die Ursache hierfür liegt in ihrem dreidimensionalen Netzwerk, wodurch ...
Translation of the abstract (German)
Seit der ersten Erwähnung von Hydrogelen 1960 waren diese im Fokus zahlreicher Studien und wurden im Zuge der Forschung stetig weiterentwickelt. Auf Grund ihrer Vielseitigkeit ermöglichen Hydrogele eine Reihe unterschiedlicher Anwendungen, wobei besonders der Einsatz als Transportvehikel einen vielversprechenden Ansatz bietet. Die Ursache hierfür liegt in ihrem dreidimensionalen Netzwerk, wodurch Hohlräume geschaffen werden, in die verschiedene Materialien eingebettet werden können. Nach Inkubation in einer wässrigen Lösung, setzen Hydrogele ihre Fracht in Abhängigkeit von Diffusion, Degradation und Quellung frei. Bei der Anwendung von Hydrogelen im menschlichen Körper können diese beispielsweise zur Behandlung verschiedenster Krankheiten eingesetzt werden, indem in ihnen eingebettete Arzneistoffe über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden. Dabei ist eine Verlängerung der Freisetzung vor allem mit chemisch kovalent vernetzten Hydrogelen, die eine erhöhte Stabilität aufweisen können, zu erreichen. Zum Beispiel konnte zur Behandlung der altersbedingten Makuladegeneration der monoklonale Antikörper Bevacizumab aus einem chemisch kovalent vernetzten Hydrogel über einen Zeitraum von 100 Tagen kontrolliert abgegeben werden. Solch ein Arzneistoffdepot ist ideal, um wiederholte Antikörperinjektionen, die oftmals mit hohen Personalkosten und geringer Patientencompliance verbunden sind, zu vermeiden.
Jedoch gibt es bei der Verwendung von chemisch kovalent vernetzten Hydrogelen zur Proteinabgabe immer noch verschiedene Hürden, die es zu überwinden gilt (Kapitel 1). Nebenreaktionen zwischen Proteinen und den funktionellen Gruppen der Hydrogelvorläufer können zu Veränderungen der Freisetzungskinetik, zu Beeinträchtigung der Proteinaktivität und sogar zu immunogenen Reaktionen führen. Zudem ist die Menge der eingebetteten Proteine begrenzt. In den meisten Fällen ist lediglich eine Beladungskapazität von unter 1 % (w/w) möglich, ohne die Freisetzungskinetik zu verändern. Die Ursache für diese Nachteile ist durch den Einsatz von Wasser zu begründen, wodurch zusätzlich die Stabilität zu Hydrolyse neigender Hydrogelvorläufer beeinträchtigt wird.
Das Ziel dieser Arbeit war es, chemisch kovalent vernetzte Hydrogele für die Langzeitfreisetzung von Proteinen herzustellen, die die Nachteile, verursacht von Wasser und anderen Lösemitteln, umgehen. Um dies zu bewerkstelligen, musste die Polymerisation im Wasserfreien durchgeführt werden. Auf diese Weise wurden Polymere hergestellt, die erst nach der Aufnahme von Wasser zu Hydrogelen quellen. Auf Grund der Definition, dass Hydrogele hydrophile polymere Netzwerke darstellen, die auf verschiedene Arten der polymeren Quervernetzung hergestellt werden können, können diese Polymere als wasserfreie Hydrogele verstanden werden.
Um zu überprüfen, ob lösemittelfreies Quervernetzen für die Hydrogelherstellung verwendet werden kann, wurden mit Furan- und Maleinimidgruppen modifizierte achtarmige Makromonomere aus Polyethylenglykol (PEG) homogen gemischt. Nach Erwärmen der Mischung über deren Schmelzpunkt wurde mit Hilfe der Rheologie die Polymerisation im geschmolzenen Zustand aufgezeichnet. Des Weiteren führte eine Reduzierung der molekularen Masse der Makromonomere zu niedrigeren Schmelzpunkten, was vorteilhaft für die Einbettung von thermolabilen Proteinen ist. Durch die Abwesenheit von Wasser konnte dabei nicht nur die Hydrolyse wassersensitiver Maleinimidgruppen sondern auch die Nebenreaktionen zwischen Maleinimiden und nukleophilen Aminosäureresten der Proteine verhindert werden. Somit wurde die Einbettung von Proteinen in ein dichteres Hydrogelnetzwek erreicht, ohne diese zu verändern. Inkubation dieser Polymere in eine wässrige Lösung resultierte in einer bis zu 35-fachen Aufnahme von Wasser bezogen auf ihre anfängliche Masse. Dabei schwankte die Stabilität zwischen 54 und 150 Tagen abhängig von der molekularen Masse der verwendeten Makromonomere. Überdies zeigte die vollständige Freisetzung des niedrigmolekularen Proteins Lysozym innerhalb von zehn Tagen, dass es zu keiner Interaktion zwischen dem Protein und nicht abreagierten Polymergruppen nach Inkubation in Wasser kam. Abschließend wurde das Modellprotein Glucoseoxidase (GOx), dessen Molekulargewicht und hydrodynamischer Durchmesser vergleichbar mit denen häufig eingesetzter Antikörper ist, von wasserfreien Hydrogelen über einen Zeitraum von 100 Tagen freigesetzt. Erhöhung der eingebetteten Proteinmenge von 5 auf 15 % (w/w) hatte keinen Einfluss auf die Freisetzungskinetik. Außerdem wurden weder Modifizierung noch Fragmentierung für das freigesetzte Protein nachgewiesen, was die schützende Eigenschaft dieses wasserfreien Arzneistoffdepots zeigte (Kapitel 3).
Zwar konnten Nebenreaktionen und Hydrolyse funktioneller Gruppen unterbunden und eine kontrollierte Proteinabgabe erreicht werden, dennoch ist die sofortige wasserfreie Gelbildung im Organismus mit der Diels-Alder (DA) Reaktion zwischen Furan und Maleinimid nicht möglich. Daher wurde die sehr schnell ablaufende Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (iEDDA) zwischen Norbornen und Tetrazin eingeführt, die bisweilen noch nicht für die Herstellung von Proteindepots für die Langzeitfreisetzung genutzt wurde. Neben der sehr schnellen Reaktionskinetik weist diese Reaktion Bioorthogonalität im wässrigen Milieu auf. Bevor mit dieser Vernetzungsreaktion wasserfreie Hydrogele hergestellt wurden, wurde das Potential der iEDDA Reaktion in Kombination mit mehrarmigen PEG Makromonomeren untersucht. Wässrige Mischungen aus achtarmigen PEGs funktionalisiert mit Norbornen und Tetrazin gelierten innerhalb einer Minute, was die Injektion auf Grund vorzeitiger Gelbildung wesentlich erschwert. Um die Handhabung zu erleichtern, wurden Polymerkonzentration, Temperatur und chemische Strukturen verändert. Daneben wurde ein kompakteres Hydrogelnetzwerk erhalten, indem eine höhere Polymerkonzentration oder Makromonomere mit kleinerem Molekulargewicht verwendet wurden. Dies resultierte zusätzlich in erhöhter mechanischer Stabilität. Anschließend wurde Lysozym eingebettet, um das Auftreten von Nebenreaktionen im wässrigen zu untersuchen. Modifizierung von lediglich 11 % des Modellproteins spiegelten die Überlegenheit der iEDDA Reaktion gegenüber der klassischen DA Reaktion hinsichtlich unerwünschter Nebenreaktionen wider. Die Degradationszeit der mittels iEDDA Reaktion hergestellter Hydrogele betrug 186 bis 530 Tage in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7.4) abhängig von der Polymerkonzentration und molekularen Masse der Hydrogelvorläufer. Die Eignung zur Anwendung als Freisetzungssystem für höhermolekulare Proteine wurde mit Hilfe der Einbettung und anschließender Freisetzung von GOx bestimmt. Die kontrollierte in vitro Freisetzung über mehr als 265 Tage verifizierte das Potential dieser Hydrogele als vielversprechendes injizierbares Langzeitabgabesystem für Proteine (Kapitel 4).
Obwohl eine verlängerte Freisetzung über einen Zeitraum von 265 Tagen erzielt wurde, stellt diese Zeitspanne ein Hindernis bezüglich Proteinstabilität dar. Beispielsweise ist die Bewahrung der Aktivität therapeutischer Proteine, die bei 37 °C längere Zeit gelagert wurden, nicht garantiert. Des Weiteren könnten Rückstände der Hydrogele wegen der langsam degradierenden Estergruppen weit nach Therapieende im Organismus noch vorhanden sein. Deshalb ist die Entwicklung von Hydrogelen mit einer veränderbaren Degradierungszeit abgestimmt auf die jeweilige Anwendung erstrebenswert. Um dies zu erreichen, wurden 3,6-Epoxy-1,2,3,6-tetrahydrophthalimide (ETPI), Carbamat, Carbonat und Phenylcarbonat als hydrolysierbare Gruppen in den PEG-Norbornen Vorläufer eingebaut. Zuallererst wurde der Einfluss der Linker auf die Fähigkeit des in situ Gelierens betrachtet. Gelpunkte unterhalb von 20 s offenbarten sofortige Gelierung für alle Hydrogelarten bereits bei Polymerkonzentrationen von 5 %. Überdies wurden die Auswirkungen der Linker auf die mechanischen Eigenschaften mittels Rheologie und Kompression analysiert. Hierbei resultierte der ETPI Linker in der höchsten Hydrogelsteifigkeit. Als Grund dafür wurde mit Hilfe der NMR Spektroskopie eine erhöhte Anzahl von Quervernetzungen ermittelt. Dagegen wurden für Hydrogele, die den Phenylcarbonatlinker beinhalten, wegen der verminderten Stabilität dieses Linkers die geringsten mechanischen Eigenschaften festgestellt. Da die Synthese dieser Hydrogelvorläufer teilweise den Einsatz toxischer Ausgangsstoffe voraussetzt, wurden alle Hydrogelformulierungen erfolgreich auf Zytokompatibilität untersucht. Um als Ziel dieses Kapitels die Erosionszeit der achtarmigen PEG-Hydogele vernetzt über die iEDDA Reaktion zu beschleunigen, wurden die Stabilitäten 5%iger Hydrogele bestimmt. Fast alle der untersuchten Hydrogele zeigten hohe Stabilitäten über mindestens 400 Tage. Einzig Hydrogele mit dem Phenylcarbonatlinker erodierten bereits nach 153 Tagen vollständig. Eine Erhöhung der Polymerkonzentration dieses Hydrogeltyps führte zu einer Stabilität über 300 Tage, was das Potential zur Modifikation der Erosionszeit je nach Anwendung zeigt. Die Maschenweiten aller Hydrogele waren im Bereich vergleichbarer Hydrogele, die ebenfalls mit achtarmigen PEGs hergestellt und bereits erfolgreich für die Proteinfreisetzung genutzt wurden. Im finalen Experiment wurde die Eignung aller Hydrogele zur Freisetzung analysiert. Dabei wurde eine kontrollierte Freisetzung von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran über mindestens 150 Tage erhalten (Kapitel 5).
Die iEDDA Reaktion wurde erfolgreich zur Herstellung in situ bildender Abgabesysteme mit variierenden Degradierungszeiten eingeführt. Jedoch waren diese Systeme wasserbasiert und Nebenreaktionen, begrenzte Beladungskapazität und die Stabilität der funktionellen Gruppen limitierte weiterhin die Verwendung dieser Hydrogele. Um diese Nachteile zu überwinden und damit das Ziel dieser Arbeit zu erreichen, wurde das erworbene Wissen hinsichtlich wasserfreier Hydrogelherstellung, in situ Gelierung mittels iEDDA Reaktion und veränderbarer Erosionszeit im finalen experimentellen Kapitel auf vierarmige PEG Makromonomere mit einer molekularen Masse von 2 kDa, die bereits unterhalb 37 °C als Flüssigkeit vorliegen, übertragen. Dazu wurden diese Makromonomere mit Norbornen und Tetrazin funktionalisiert. Mischen beider Vorläuferflüssigkeiten verursachte die Bildung eines Polymers via iEDDA Reaktion, was mit Hilfe der FTIR und UV-VIS Spektroskopie bestätigt wurde. Um die Fähigkeit der in situ Gelierung unter Beweis zu stellen, wurden die flüssigen Vorläufer gemischt und die Gelierungszeit bestimmt. Die Polymere zeigten schnelle Gelierung mit Gelpunkten unterhalb von 11 s. Chemische Modifizierung von Norbornen und Tetrazin veränderte sowohl Gelierungszeit und Steifigkeit als auch die dreidimensionale Struktur der Hydrogele. Trotz des Einbaus von hydrolysierbaren Gruppen wiesen die Polymere hohe Stabilität über mindestens 200 Tage auf. Im Schlussexperiment wurde die Verwendbarkeit zur Proteinabgabe betrachtet. Dafür wurde GOx als Modellprotein in die Polymere eingebettet. Die Polymere waren in der Lage, das Protein über 475 Tage kontrolliert freizusetzen, was das hohe Potential dieser polymeren Materialien erkennen lässt (Kapitel 6).
Metadata last modified: 23 May 2023 05:29
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