The eukaryotic cell has to organize its 2 m DNA into higher order structures to fit into the 10 μm nucleus. The DNA is associated with proteins and RNA to form the so called chromatin with its basic subunit the nucleosome, representing a 147 bp long B-DNA, wrapped 1.65x around a histone octamer. It is generally assumed that the nucleosome array is hierarchically folded in higher compaction ...
Abstract (English)
The eukaryotic cell has to organize its 2 m DNA into higher order structures to fit into the 10 μm nucleus. The DNA is associated with proteins and RNA to form the so called chromatin with its basic subunit the nucleosome, representing a 147 bp long B-DNA, wrapped 1.65x around a histone octamer. It is generally assumed that the nucleosome array is hierarchically folded in higher compaction levels. Active mechanisms exist that alter chromatin structure in order to retain its accessibility as well as intended inaccessibility. These dynamic modifications are crucial to the chromatin to regulate DNA accessibility to ensure DNA dependent processes like replication, transcription, or DNA repair. These dynamics are e.g. achieved by ATP dependent chromatin remodeling enzymes, which use the energy of ATP hydrolysis to translocate histoneoctamers along ds DNA. All active chromatin remodeler, shown so far, are members of the Snf2 family of the helicase Super Family 2 (SF2), classified by their similar ATPase domain. Two members of the Mi-2 subfamily, the ATPases CHD3 and CHD4 (Chromodomain, Helicase, DNA binding), are part of the multiprotein complex NuRD (Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation). Misregulation or mutation of the chromatin remodelers CHD3 and CHD4 where shown to play a role in the pathogenesis of cancer or mesenchymal diseases like dermatomyositis. Remodelers are highly regulated in activity and by still badly characterized in mechanisms on specific genomic loci. This regulation can be achieved by interacting with distinct partners for example: Transcription factors. Preliminary work of our lab showed an interaction of CHD3 and CHD4 with the myeloid and B-cell-specific transcription factor PU.1 in vitro. Here it is shown, that the interaction of the remodeling enzymes CHD3/4 and PU.1 also occur in context of living cells. We used in-house- made stably transfected HEK293 Flp-InTM T-Rex cells dox-inducible co-expressing either CHD3-GFP, CHD4-GFP and GFP with hPU.1-C-Myc-His. The cells were first verified by immunocytochemistry conductively showing sufficient inducible expression levels and correct localization of the proteins of interest. Second, the interaction of CHD3/CHD4-GFP and PU.1 was investigated by co-immunoprecipitation experiments by pulling down one interaction partner at a time followed in western blot analyses. We clearly could show an DNA- independent interaction between CHD3/CHD4-GFP and PU.1 and also in context of NuRD in the GFP-pulldown.
Translation of the abstract (German)
Die eukaryotische DNA unterliegt aufgrund ihrer Länge von ca. 2 m komplexen Mechanismen, um eine Kompaktierung als sog. Chromatin im 10 μm großen Zellkern zu ermöglichen.
Die kleinste Untereinheit (UE) des Chromatin bildet das Nukleosom, bestehend aus 147 DNA- Basenpaaren, die sich 1,65x um ein Histonoktamer winden. Höhere DNA-Kompaktierungen bis hin zum Metaphasenchromosom erfolgen in ...
Translation of the abstract (German)
Die eukaryotische DNA unterliegt aufgrund ihrer Länge von ca. 2 m komplexen Mechanismen, um eine Kompaktierung als sog. Chromatin im 10 μm großen Zellkern zu ermöglichen.
Die kleinste Untereinheit (UE) des Chromatin bildet das Nukleosom, bestehend aus 147 DNA- Basenpaaren, die sich 1,65x um ein Histonoktamer winden. Höhere DNA-Kompaktierungen bis hin zum Metaphasenchromosom erfolgen in Assoziation mit weiteren Proteinen sowie Ribonukleinsäuren. Um dabei eine adäquate Zugänglichkeit und v.a. Unzugänglichkeit für DNA-abhängige Prozesse wie DNA-Replikation, -Transkription und -Reparatur zu erreichen, ist ein stetiger und dynamischer Umbau des Chromatins nötig. Dieser erfolgt u.a. durch ATP- abhängige Chromatin Remodeling Enzyme.
Alle Chromatin Remodeler werden anhand ihrer ähnlichen ATPase-Domäne zur Snf2-Familie der Helicase Super Familie 2 (SF2) zusammengefasst. Sie verwenden die Energie aus der ATP- Hydrolyse, um die Nukleosome entlang der DNA zu repositionieren, sie zu entfernen oder einzufügen. Zwei Mitglieder ihrer Mi-2 Unterfamilie, CHD3 und CHD4 (Chromodomain, Helicase, DNA binding), sind zudem Bestandteil des NuRD-Komplex (Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation). Werden sie fehlreguliert, führt dies zu einer Missverhältnis der DNA-abhängigen Prozesse und spiegelt sich in der Pathogenese verschiedener Tumore sowie Krankheiten wie der Dermatomyositis wieder. Daher ist eine strenge Regulation der Chromatin Remodeler essentiell. Dies geschieht z.B. durch Interaktion mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren.
Vorangegangene Arbeiten unseres Labor konnten bereits eine in vitro Interaktion zwischen den beiden Chromatin Remodelern CHD3 und CHD4 mit dem myolischen B-Zell-spezifischen Transkriptionsfaktor PU.1 zeigen. Anknüpfend daran, wurden in dieser Studie stabil transfizierte HEK293 Flp-InTM T-Rex Zellen verwendet, die Doxyzyklin-induzierbar entweder CHD3-GFP, CHD4-GFP oder GFP zusammen mit hPU.1-C-Myc-His ko-exprimieren. Die hinreichende Proteinexpression sowie -lokalisation wurde mittels Immunhistochemie sowie Western Blot in einem ersten Schritt validiert. Anschließend wurde durch Co- Immunopräzipitationen (Co-IP) die Interaktion zwischen CHD3/CHD4-GFP und PU.1 analysiert. Dabei wurde jeweils ein Interaktionspartner präzipitiert und auf die Co-Präzipitation des anderen sowie NuRD-UEs untersucht. Wir konnten hierbei eine DNA-unabhängige Interaktion zwischen den Interaktionspartnern CHD3/CHD4-GFP und PU.1, sowie in Assoziation mit NuRD zeigen.
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