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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-526905
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.52690
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 July 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Antje J. Bäumner |
| Date of exam: | 22 July 2022 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, formerly Prof. Wolfbeis) |
| Keywords: | Biosensors, Glucose, Lactate, Potassium, Optical Detection, Electrochemical Detection, Oxidase, Europium Tetracycline, Sweat Analysis, Wearable Sensor, Continuous Monitoring |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 52690 |
Abstract (English)
The main aspect of the thesis is the development of bio- and chemosensors for clinical and personal healthcare applications with new and common materials addressing important model analytes like glucose and lactate, but also potassium ions and electrolytes in general by optical and electrochemical detection methods. Since all developed bioanalytical sensors are exploiting different properties of ...
Abstract (English)
The main aspect of the thesis is the development of bio- and chemosensors for clinical and personal healthcare applications with new and common materials addressing important model analytes like glucose and lactate, but also potassium ions and electrolytes in general by optical and electrochemical detection methods. Since all developed bioanalytical sensors are exploiting different properties of hydrogels and polymers, a critical review highlights advantages and disadvantages of current polymer deposition techniques, and if a genuine commercialization of the presented sensor concepts is possible. It should also be mentioned that not just in the field of medical and point-of-care (POC) applications electrochemical and optical sensors and biosensors with polymeric layers are widely used, but for food safety and environmental issues, too.
A multianalyte sensor using exclusively laser-induce graphene (LIG)-based electrodes was developed for non-invasive eccrine sweat analysis. The relatively new material provides a 3-dimensional graphene-like structure, can be manufactured easier than any other carbon electrode also on industrial scale, and can be modified without large effort. Therefore, LIG is predestinated for affordable wearable POC sensors. It is demonstrated that LIG can address all three electrochemical sensing strategies (voltammetry, potentiometry, impedance) in a multianalyte system for sweat sensing.
A potentiometric potassium ion-selective electrode in combination with an electrodeposited Ag/AgCl reference electrode (RE) enabled the detection of potassium ions in the entire physiologically relevant range (1 mM to 500 mM) within seconds, unaffected by the presence of main interfering ions like chloride or sodium ions, and different sweat collecting materials. A kidney-shaped interdigitated unmodified LIG electrode allows the determination of the overall electrolyte concentration by electrochemical impedance spectroscopy at a fixed frequency. Enzyme-based strategies with amperometric detection share the common RE and were realized with Prussian blue as electron mediator and the biocompatible chitosan for enzyme immobilization and protection of the electrode. Using glucose and lactate oxidases, lower limits of detection of 13.7 ± 0.5 µM for glucose and 28 ± 3 µM for lactate were obtained, respectively. The sensor showed a good performance within the relevant pH range, with sweat collecting tissues, on a model skin system and furthermore in synthetic sweat as well as in artificial tear fluid. Response time for each analytical cycle totals 75 seconds, and hence allows a quasi-continuous and simultaneous monitoring if all analytes. This multianalyte all-LIG system is therefore a practical, versatile, and most simple strategy for POC applications and has the potential to outcompete standard screen-printed electrodes.
The Europium(III) tetracycline complex (EuTc) is an optical probe for the sensitive detection of hydrogen peroxide (HP) at physiological relevant pH. In aqueous solution the inner coordination sphere of the Eu3+ central ion is surrounded by water molecules. This coordination leads to a quenched luminescence of the 5D0→7F2 transition of the lanthanide ion, detectable at 616 nm after an excitation at 405 nm. Reversible replacement of these water molecules by HP leads to an up to 16-fold enhancement of luminescence intensity. Combination of the probe with lactate oxidase (LOx) und glucose oxidase (GOx) forming HP as stoichiometric by-product during their catalytic reaction, enables the rapid and sensitive detection of the related substrates. The entrapment of the very selective enzyme and the sensitive luminescent probe within biocompatible hydrogels and polymers enlarges the thinkable bioanalytical applications enormously. The developed hydrogel-based sensor discs can be used in a microplate format as well as in flow-through systems for high-throughput detection and long-term monitoring.
Suitable hydrogels and polymers were investigated for the entrapment of the luminescent probe and the respective oxidase enzymes GOx and LOx. The polymer cocktails containing probe or enzyme were knife-coated with 30 µm wet thickness on an in-house made coating device on transparent polyethylene terephthalate substrate sheets. Circular discs were hole-punched from the foils after drying and washing, and were stuck to a 96-well microplate. Within microplate assay approaches the systems were optimized regarding the used polymers and hydrogels, solvents, and the probe as well as the enzyme content.
A polyvinyl acetate/cellulose acetate (PVAc/CA) membrane was found as suitable for containing EuTc to detect HP. The probe was also embedded in a Hydromed® D4 layer protected by a PVAc/CA layer to reach a dynamic range from 10 µM to 10 mM HP. Glucose samples up to 50 mM and lactate samples up to 20 mM are mixed with the respective enzyme and added to the discs in a 96-well plate. After 2 min to 5 min incubation time the luminescence is read out at 616 nm. D4-enzyme discs were produced and optimized to detect glucose and lactate under comparable conditions within the same dynamic range as mentioned above when the sample solution is mixed with EuTc solution in the microplate. The systems work at 25°C and 37°C. The discs can be stored light-protected for at least 6 months (probe discs) or up to 1 year (enzyme discs) at 4°C. They show no significant loss of probe or enzyme when in use for minimum 3 h at 37°C (probe discs) or 6 h at 25°C (enzyme discs). This fundamental work proves the reasonable application of EuTc and enzymes embedded in biocompatible hydrogels for rapid hydrogen peroxide, glucose and lactate detection in a microplate format within physiological relevant concentrations and conditions and should be transferred into a flow-through system.
The combination of enzyme and probe in a one- or multilayer setup was investigated using different techniques since it simplifies the integration into a flow cell system, but up to now no satisfying solution was found. Therefore, the optimized EuTc and enzyme sensor discs were placed adjacently within the flow cell chamber to prove at least the fundamental concept of continuous monitoring. Some scope for further optimization regarding the perfect balance of probe/enzyme ratio and instrumental and experimental settings like flow speed and flow-cell geometry was left and discussed as future perspective.
Translation of the abstract (German)
Der Hauptaspekt dieser Dissertation ist die Entwicklung von Bio- und Chemosensoren für klinische und individuelle Gesundheitsanwendungen mit neuen und bekannten Materialien, die wichtige Modellanalyten wie Glucose und Lactat, aber auch Kaliumionen und Elektrolyte im Allgemeinen durch optische und elektrochemische Detektionsmethoden adressieren. Da alle entwickelten bioanalytischen Sensoren ...
Translation of the abstract (German)
Der Hauptaspekt dieser Dissertation ist die Entwicklung von Bio- und Chemosensoren für klinische und individuelle Gesundheitsanwendungen mit neuen und bekannten Materialien, die wichtige Modellanalyten wie Glucose und Lactat, aber auch Kaliumionen und Elektrolyte im Allgemeinen durch optische und elektrochemische Detektionsmethoden adressieren. Da alle entwickelten bioanalytischen Sensoren unterschiedliche Eigenschaften von Hydrogelen und Polymeren ausnutzen, hebt eine kritische Überprüfung die Vor- und Nachteile der aktuellen Polymerabscheidungstechniken hervor und ob eine echte Kommerzialisierung der vorgestellten Sensorkonzepte möglich ist. Erwähnenswert ist auch, dass elektrochemische und optische Sensoren sowie Biosensoren mit Polymerschichten nicht nur im Bereich der Medizin und Point-of-Care (POC)-Anwendungen weit verbreitet sind, sondern auch für Lebensmittelsicherheit und Umweltfragen.
Für die nicht-invasive Analyse von ekkrinem Schweiß wurde ein Multianalytensensor entwickelt, der ausschließlich auf laserinduzierten Graphen (LIG) Elektroden basiert. Das relativ neue Material bietet eine 3-dimensionale Graphen-ähnliche Struktur, lässt sich einfacher als jede andere kohlenstoffbasierte Elektrode auch im industriellen Maßstab herstellen und ohne großen Aufwand modifizieren und ist damit prädestiniert für erschwingliche Wearables and POC-Systeme. Es wird gezeigt, dass LIG alle drei elektrochemischen Messstrategien (Voltammetrie, Potentiometrie, Impedanz) in einem Multianalytensystem für die Detektion in Körperflüssigkeiten zusammenfassen kann.
Eine potentiometrische Kaliumionen-selektive Elektrode in Kombination mit einer galvanisch abgeschiedenen Ag/AgCl-Referenzelektrode (RE) ermöglicht den sekundenschnellen Nachweis von Kaliumionen im gesamten physiologisch relevanten Bereich (1 mM bis 500 mM), unabhängig von der Anwesenheit von Hauptstörionen wie Chlorid- oder Natriumionen und verschiedenen absorbierenden Materialien. Eine nierenförmig ineinandergreifende nichtmodifizierte LIG-Elektrode ermöglicht die Bestimmung der Gesamtelektrolytkonzentration durch elektrochemische Impedanzspektroskopie bei einer konstanten Frequenz. Die amperometrische Detektion mit enzymbasierten Strategien nutzt die gemeinsame RE. Die Arbeitselektrode wurde mit Berliner Blau als Elektronenmediator und einer biokompatiblen Chitosanschicht für die Enzymimmobilisierung und zum Schutz der Elektrode modifiziert. Unter Verwendung von Glucoseoxidase (GOx) und Lactatoxidase (LOx) wurden untere Nachweisgrenzen von 13,7 ± 0,5 µM für Glucose bzw. 28 ± 3 µM für Lactat erzielt. Der Sensor zeigt eine gute Leistung im relevanten pH-Bereich, mit absorbierenden Geweben, auf einem Modellhautsystem und darüber hinaus in synthetischem Schweiß sowie in künstlicher Tränenflüssigkeit. Die Reaktionszeit für jeden Analysezyklus beträgt insgesamt 75 Sekunden und ermöglicht somit eine quasi-kontinuierliche und gleichzeitige Überwachung aller Analyten. Dieses Multianalyt-All-LIG-System ist daher eine praktische, vielseitige und einfachste Strategie für POC-Anwendungen und hat das Potenzial, standardmäßig genutzte siebgedruckte Elektroden zu übertreffen.
Der Europium(III)-Tetracyclin-Komplex (EuTc) ist eine optische Sonde zum sensitiven Nachweis von Wasserstoffperoxid (HP) bei physiologisch relevanten pH-Werten. In wässriger Lösung ist die innere Koordinationssphäre des Eu3+-Zentralions von Wassermolekülen umgeben. Diese Koordination führt zu einer reduzierten Lumineszenz des 5D0→7F2-Übergangs des Lanthanid-Ions, nachweisbar bei 616 nm nach einer Anregung bei 405 nm. Der reversible Austausch dieser Wassermoleküle durch HP führt zu einer bis zu 16-fachen Steigerung der Lumineszenzintensität. Die Kombination des Komplexes mit LOx und GOx, die bei ihrer katalytischen Reaktion HP als stöchiometrisches Nebenprodukt bilden, ermöglicht den schnellen und sensitiven Nachweis der jeweiligen Substrate. Der Einschluss des sehr selektiven Enzyms und der empfindlichen lumineszierenden Sonde in biokompatible Hydrogele und Polymere erweitert die denkbaren bioanalytischen Anwendungen enorm. Die entwickelten Hydrogel-basierten Sensor Discs können sowohl im Mikroplattenformat als auch in Durchflusssystemen zur Hochdurchsatzdetektion und Langzeitüberwachung eingesetzt werden.
Geeignete Hydrogele und Polymere wurden für den Einschluss der lumineszierenden Sonde und der entsprechenden Enzyme GOx und LOx untersucht. Die Polymercocktails, die die Sonde oder das Enzym enthielten, wurden mit einer Nassdicke von 30 µm auf einer selbstentwickelten Beschichtungsvorrichtung auf transparente Polyethylenterephthalat-Substratfolien aufgetragen. Aus den Folien wurden nach dem Trocknen und Waschen kreisförmige Discs ausgestanzt und in eine 96-Well Microplate geklebt. Die Systeme wurden hinsichtlich der verwendeten Polymere und Hydrogele, Lösungsmittel sowie des Komplex- und Enzymgehalts innerhalb der Microplate Assays optimiert.
Eine Membran aus Polyvinylacetat/Celluloseacetat (PVAc/CA) wurde als geeignet gefunden, um EuTc sicher einzubetten und HP nachzuweisen. Die Sonde wurde auch in eine Hydromed® D4-Schicht eingebettet, die durch eine PVAc/CA-Schicht geschützt war, um einen dynamischen Messbereich zwischen 10 µM bis 10 mM HP zu erzielen. Glucoseproben bis 50 mM und Lactatproben bis 20 mM werden mit dem jeweiligen Enzym gemischt und auf die Discs in einer 96-Well-Platte gegeben. Nach zwei bis fünf Minuten Inkubationszeit wird die Lumineszenzintensität bei 616 nm ausgelesen. D4-Enzym Discs wurden entwickelt und optimiert, um Glucose und Lactat unter vergleichbaren Bedingungen wie oben erwähnt nachzuweisen, wenn die Probenlösung mit EuTc-Lösung in der Microplate gemischt werden. Die Systeme funtionieren bei 25°C und 37°C. Die Discs können lichtgeschützt mindestens 6 Monate (EuTc Discs) bzw. bis zu 1 Jahr (Enzym Discs) bei 4°C gelagert werden. Die Discs zeigen keinen signifikanten EuTc- oder Enzymverlust, wenn sie über 3 h bei 37°C (EuTc Discs) oder 6 h bei 25 °C (Enzym Discs) verwendet werden. Diese Grundlagenarbeit beweist die sinnvolle Anwendung von EuTc und Enzymen eingebettet in biokompatible Hydrogele zum schnellen Nachweis von Wasserstoffperoxid, Glucose und Lactate im Microplate Format für physiologisch relevante Konzentrationen und unter ebensolchen Bedingungen. Die Discs sollen im weiteren Verlauf in ein Durchflusssystem überführt werden.
Die Kombination von Enzym und Sonde in einem ein- oder mehrschichtigen Aufbau wurde mit verschiedenen Techniken versucht zu realisieren, da dies die Integration in ein Durchflusssystem vereinfacht, aber bisher wurde keine zufriedenstellende Lösung gefunden. Deshalb wurden die optimierten EuTc Discs und Enzym Discs nebeneinander in der Durchflusszellenkammer platziert um zumindest das grundlegende Konzept der kontinuierlichen Überwachung beweisen zu können. Ein Spielraum für weitere Optimierungen hinsichtlich der perfekten Balance zwischen EuTc/Enzym-Verhältnis und instrumentellen und experimentellen Einstellungen wie Strömungsgeschwindigkeit und Strömungszellengeometrie bleibt weiterhin offen und wird, unter anderem, als Zukunftsaussichten diskutiert.
Metadata last modified: 22 Jul 2024 07:44
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