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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-532871
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.53287
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 2 December 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 17 October 2022 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | biochemistry, protein evolution, protein design, secondary metabolism, xenobiotic metabolism |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 53287 |
Abstract (English)
Enzymes are highly specialized and efficient biocatalysts, absolutely essential for all cellular life on earth. Like species as a whole, enzymes are subject to gradual changes, based on spontaneous mutations in their respective genes, which can bring about new structural and functional features in the resulting novel enzyme. Where these features are beneficial to the organism’s survival, they ...
Abstract (English)
Enzymes are highly specialized and efficient biocatalysts, absolutely essential for all cellular life on earth. Like species as a whole, enzymes are subject to gradual changes, based on spontaneous mutations in their respective genes, which can bring about new structural and functional features in the resulting novel enzyme. Where these features are beneficial to the organism’s survival, they present a selection advantage, leading to the retention and amplification of the new enzyme variant. The emergence of new catalytic functions as the result of enzyme evolution is a particularly interesting and complex process the understanding of which can provide valuable new impulses for the field of enzyme design.
Isochorismatase (EntB) and 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybenzoate dehydrogenase (EntA) are part of the secondary metabolic enterobactin pathway of Escherichia coli, contributing to iron uptake of the organism. As it is generally accepted that secondary metabolic enzymes evolved from primary metabolic ones, it was attempted to establish EntB and EntA activity in their closest respective primary metabolic homologues, ureidoacrylate amidohydrolase (RutB) and 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase (FabG), in an effort to understand the underlying evolutionary processes.
Due to a rational approach previously remaining unsuccessful, a number of strategies was applied to achieve functional conversion. Bioinformatic tools, specifically aimed at functional conversion or diversification, were employed to suggest sets of residue exchanges for RutB and FabG, that might alter the respective substrate specificity. The involvement of the target enzymes in the production of the siderophore enterobactin allowed the establishment of selective growth conditions, based on limiting the bio-availability of iron in growth media by addition of chelating agents. Strains with genomic deletions of entB-IC (coding for the isochorismatase domain of EntB) and entA did not grow under these conditions but could be rescued by a plasmid-borne copy of the respective gene, establishing a viable system for gene library selection. Fully-randomized gene libraries of rutB and fabG were created alongside a focused gene library of rutB. Transformation into the applicable deletion strain and subjection to the selective growth conditions revealed single gene variants which lead to colony growth on agar plates or overperformance in liquid medium.
However, all efforts eventually proved unsuccessful as none of the isolated or computationally predicted variants of RutB and FabG displayed EntB and EntA activity, respectively. One notable effect observed for several FabG variants was an improved growth of the entA deletion strain under iron limiting conditions, which may be due to an unknown, newly acquired function.
The ureidoacrylate amidohydrolase RutB from E. coli is part of the Rut pathway for pyrimidine utilization. It was considered as a potential progenitor of the isochorismatase EntB and further was one of only two enzymes of the Rut pathway for which a crystal structure had not been reported, thus meriting detailed investigation. A further motivating factor is the potential relevance of RutB for the pharmaceutical industry due to its (+)-γ-lactamase side activity.
In this work, a protocol for the synthesis of the RutB substrate ureidoacrylate was developed, yielding milligram quantities of the compound. Wild-type RutB was produced in sufficient quantities to conduct crystallization screens and subsequent refinement of crystallization conditions. Crystals of selenomethioninelabeled RutB were produced, allowing for the initial solution of a crystal structure of wild-type RutB at a resolution of 1.9 Å. RutB was further co-crystallized with the substrate analogue ureidopropionate, revealing the mode of substrate binding. Additionally, the inactive RutB variants D24N and C166S were cocrystallized with the substrate ureidoacrylate and structures were solved, revealing the presence of acetate within the active site of RutB C166S.
Various residue exchanges of D24, K133, and C166 produced inactive variants, identifying these three residues as the catalytic triad of RutB. Further residue exchanges were selected based on visual inspection of the active site of RutB and their various effects on the catalytic parameters of ureidoacrylate amidohydrolysis, as determined by a guanine deaminase-coupled assay, allowed for the formulation of a detailed reaction mechanism of RutB.
The detailed insight into the mechanism of RutB, that was gained in this work, could be the foundation of an investigation into the evolutionary history of RutB. A future project for the directed evolution of the (+)-γ-lactamase activity of RutB, based on the data presented in this work, could also be conceived.
Non-natural substances introduced into the environment through human action, including pesticides, fertilizer, and chemical waste, represent novel evolutionary factors to natural life. These so called anthropogenic substances have lead to a number of specific adaptations of target and non-target organisms, among them the emergence of novel enzyme functions. A number of microbial species employ the Atz pathway for the utilization of the herbicide atrazine and a number of similar s-triazine compounds, mainly as a nitrogen source. Certain enzymes of the Atz pathway can be assumed to have emerged only after the widespread introduction of atrazine into the environment, starting in the 1950s.
AtzB, the second enzyme in this pathway, is a hydroxyatrazine ethylaminohydrolase, which was previously shown to exhibit a minor guanine deaminase side activity. In this work, the evolutionary history of AtzB was reconstructed by introduction of a set of residue exchanges inferred by comparison of the closest known homologues. Step-wise introduction of these residue exchanges into AtzB produced continuously improved guanine deaminase variants with each iteration. The sequential introduction of S218C, S219Q, I170N, and I222N established an evolutionary trajectory, along which catalytic efficiency (kcat/KM) for guanine increased from <2 M-1s-1 to 3.9e3 M-1s-1, while the catalytic efficiency for hydroxyatrazine dropped from 2.4e5 M-1s-1 to 2.9e2 M-1s-1. This quadruple variant (AtzB CQNN) represents a pseudo-progenitor of AtzB, due to its physiologically relevant guanine deaminase activity, promiscuous hydroxyatrazine hydrolase activity, and its direct evolvability into wild-type AtzB.
The closest known sequence homologues of AtzB, AtzB_Hom_Hal and AtzB_Hom_Pleo, could be shown to be modest guanine deaminases with kcat/KM values of 1.1e3 M-1s-1 and 2.2e3 M-1s-1, respectively. Both enzymes exhibited a minor side activity for hydroxyatrazine. Introduction of some of the residue exchanges constituting the evolutionary trajectory established for AtzB produced variants with increased hydroxyatrazine ethylaminohydrolase activities. AtzB_Hom_Hal C209S Q210S possesses a catalytic efficiency of 4.4e2M-1s-1 and AtzB_Hom_Pleo N165I C213S Q214S N217I even surpasses wild-type AtzB with 3.0e5 M-1s-1. The AtzB homologues are thus viable evolutionary progenitors of alternative AtzB enzymes.
HPLC-based analysis of the products of hydroxyatrazine hydrolysis revealed that the presence of a serine dyad (S218 S219 in AtzB) is sufficient and required for the specific substrate binding orientation resulting in hydroxyatrazine ethylaminohydrolase activity.
Recent work has further identified a previously undescribed N2,N2-dimethylguanine dimethylaminohydrolase activity in AtzB and AtzB_Hom_Pleo. This function may represent the actual enzymatic activity of the AtzB progenitor.
Translation of the abstract (German)
Enzyme sind hochspezifische und effiziente Biokatalysatoren, die für jede Form von Leben auf der Erde unerlässlich sind. Ähnlich den Individuen einer Spezies, verändern sich auch Enzyme im Laufe der Evolution. Spontane Mutationen in einem entsprechenden Gen können die strukturellen und funktionellen Eigenschaften eines Enzyms verändern. Sind diese Änderungen für den Organismus vorteilhaft, stellt ...
Translation of the abstract (German)
Enzyme sind hochspezifische und effiziente Biokatalysatoren, die für jede Form von Leben auf der Erde unerlässlich sind. Ähnlich den Individuen einer Spezies, verändern sich auch Enzyme im Laufe der Evolution. Spontane Mutationen in einem entsprechenden Gen können die strukturellen und funktionellen Eigenschaften eines Enzyms verändern. Sind diese Änderungen für den Organismus vorteilhaft, stellt die neue Enzymvariante einen Selektionsvorteil dar, der schließlich zu ihrer Verbreitung führt.
Die Entstehung neuer Enzymfunktionen als Resultat dieser Enzymevolution ist ein faszinierender und komplexer Vorgang, dessen Erforschung wertvolle neue Impulse für das Feld des Enzymdesigns geben kann.
Die Enzyme Isochorismatase (EntB) und 2,3-Dihydro-2,3-dihydroxybenzoat-Dehydrogenase (EntA) sind Teil des sekundärmetabolischen Enterobactin-Stoffwechselweges, der in Escherichia coli einen Mechanismus zur Eisenaufnahme darstellt. Es ist generell akzeptiert, dass sekundärmetabolische Enzyme aus primärmetabolischen Vorläufern entstanden sind, weshalb in dieser Arbeit versucht wurde, die Aktivitäten von EntB und EntA in ihren nächsten primärmetabolischen Homologen zu etablieren. Diese sind Ureidoacrylat-Amidohydrolase (RutB) und 3-Oxoacyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Reduktase (FabG). Diese Funktionsumwandlungen sollten Hinweise auf die der Entstehung von EntB und EntA zugrundeliegenden evolutionären Prozesse geben.
Nachdem ein rationaler Ansatz der funktionellen Umwandlung zuvor erfolglos geblieben war, wurden in dieser Arbeit eine Reihe von Strategien angewandt. Zwei bioinformatische Methoden, die speziell für funktionelle Umwandlung beziehungsweise Diversifizierung entwickelt worden waren, ergaben eine Reihe von Vorschlägen für Residuenaustausche in RutB und FabG, die die Substratspezifität dieser Enzyme verändern könnten. Aufgrund der Beteiligung der Zielenzyme an der Synthese des Siderophors Enterobactin, konnte ein spezifisches Selektionssystem entwickelt werden, indem durch Zugabe geeigneter Chelatoren zum Wachstumsmedium Eisenmangelbedingungen erzeugt wurden. Stämme mit deletiertem entB-IC (Bereich des Gens, der für die Isochorismatasedomäne von EntB kodiert) beziehungsweise entA Gen konnten unter diesen Bedingungen nicht wachsen, jedoch durch eine plasmidkodierte Kopie des jeweils deletierten Gens gerettet werden. Vollständig randomisierte Genbanken der Gene rutB und fabG wurden erzeugt und in den jeweiligen Deletionsstamm transformiert. Unter selektiven Wachstumsbedingungen traten einzelne Genvarianten hervor, die das Wachstum der Deletionsstämme unter Eisenmangelbedingungen wiederherstellten.
Funktionelle Untersuchungen zeigten jedoch, dass keine der bioinformatisch vorgeschlagenen oder aus den Genbanken isolierten Varianten von RutB und FabG die Aktivitäten von EntB beziehungsweise EntA besaßen. Einige der FabG Varianten zeigten jedoch reproduzierbar eine Verbesserung der Wachstumsgeschwindigkeit des entA Deletionsstamms unter Eisenmangelbedingungen, was auf eine unbekannte, neue Funktion zurückzuführen sein könnte.
Das Enzym Ureidoacrylat-Amidohydrolase (RutB) aus E. coli ist Teil des Rut-Stoffwechselweges zum Abbau von Pyrimidinen. Da es einerseits als ein Vorläufer der Isochorismatase (EntB) angesehen wurde und außerdem eines von nur zwei Enzymen seines Stoffwechselweges war, von denen keine Kristallstruktur bekannt war, wurde eine detaillierte Untersuchung dieses Enzyms unternommen. Ferner existiert eine mögliche Relevanz von RutB für die pharmazeutische Industrie aufgrund seiner (+)-γ-Lactamase Aktivität.
Die Etablierung eines Protokolls für die Synthese von Ureidoacrylat, dem Substrat von RutB, ermöglichte die Produktion dieser Substanz im Milligramm-Maßstab. Wildtypisches RutB konnte in ausreichender Menge hergestellt werden, um Kristallisationsbedingungen für dieses Enzym zu etablieren und zu optimieren. Mit Selenomethionin markiertes RutB wurde kristallisiert und zur initialen Strukturaufklärung verwendet, wodurch erstmalig eine Struktur von RutB, mit einer Auflösung von 1.9 Å, gelöst werden konnte. Weiterhin wurde RutB mit dem Substratanalogon Ureidopropionat kokristallisiert, wodurch der Modus der Substratbindung aufgeklärt werden konnte. Die Kokristallisation der katalytisch inaktiven RutB Varianten D24N und C166S mit dem Substrat Ureidoacrylat und nachfolgende Strukturaufklärung zeigte das Vorhandensein zweier Moleküle Azetat im aktiven Zentrum von RutB C166S.
Zur Bestimmung des Umsatzes von Ureidoacrylat wurde ein an Glutamat-Dehydrogenase gekoppelter Enzymassay etabliert. Verschiedene Austausche der Residuen D24, K133 und C166 führten zu nahezu vollständig inaktiven Enzymvarianten, was diese drei Reste als die katalytische Triade von RutB bestätigte. Weitere Residuenaustausche in der Substratbindetasche von RutB hatten spezifische Effekte auf den kcat und den KM Wert des Enzyms, durch die der Reaktionsmechanismus von RutB aufgeklärt werden konnte.
Die detaillierte strukturelle und mechanistische Untersuchung von RutB, die in dieser Arbeit präsentiert wird, kann als Grundlage für die Erforschung der evolutionären Vergangenheit von RutB dienen. Ein weiteres Projekt könnte auf die Verstärkung der (+)-γ-Lactamase Aktivität von RutB abzielen.
Die Freisetzung synthetischer Substanzen in Form von Pestiziden, Düngern und Chemieabfällen hat die Natur vor neue Herausforderungen gestellt. Verschiedene Spezies haben auf die Anwesenheit dieser anthropogenen Substanzen mit spezifischen Anpassungen reagiert, darunter auch die Evolvierung neuer Enzymfunktionen. Einige Mikroorganismen nutzen den Atz-Stoffwechselweg um das Herbizid Atrazin und ähnliche s-Triazin Herbizide abbauen und als Stickstoffquelle nutzen zu können. Es ist anzunehmen, dass die Enzyme dieses Stoffwechselweges sich erst in jüngster Zeit, nach Beginn der großflächigen Ausbringung von Atrazin ab den 1950er Jahren, evolviert haben.
AtzB, das zweite Enzym dieses Stoffwechselweges, ist eine Hydroxyatrazin-Ethylaminohydrolase, in der jüngst eine promiskuitive Guanin-Desaminaseaktivität nachgewiesen werden konnte. In dieser Arbeit wurde die evolutionäre Vergangenheit von AtzB rekonstruiert, indem verschiedene Residuenaustausche, basierend auf den Sequenzen der nächsten Homologen von AtzB, untersucht wurden. Die schrittweise Einführung dieser Austausche in AtzB führte zu Varianten mit sukzessive verbesserten Guanin-Desaminaseaktivitäten. Die aufeinanderfolgende Einführung von S218C, S219Q, I170N und I222N stellt eine reverse evolutionäre Trajektorie dar, entlang derer die katalytische Effizienz (kcat/KM) für Guanin von <2 M-1s-1 auf 3.9e3 M-1s-1 steigt, während die katalytische Effizienz für Hydroxyatrazin von 2.4e5 M-1s-1 auf 2.9e2 M-1s-1 fällt. Die resultierende Vierfachvariante (AtzB CQNN) stellt aufgrund ihrer potentiell physiologisch relevanten Guanin-Desaminaseaktivität, ihrer promiskuitiven Hydroxyatrazin-Hydrolaseaktivität und ihres evolutionären Potentials in Richtung des wildtypischen AtzB, einen Pseudovorläufer von AtzB dar.
Die nächsten bekannten Sequenzhomologen von AtzB (AtzB_Hom_Hal und AtzB_Hom_Pleo) wurden in dieser Arbeit als moderat aktive Guanin-Desaminasen mit kcat/KM Werten von 1.1e3 M-1s-1 beziehungsweise 2.2e3 M-1s-1 identifiziert. In beiden Enzymen zeigte sich zudem eine geringe Hydroxyatrazin-Hydrolaseaktivität, die durch Einführung inverser Residuenaustausche der oben beschriebenen evolutionären Trajektorie jeweils verbessert werden konnte. AtzB_Hom_Hal C209S Q210S zeigte eine katalytische Effizienz von 4.4e2 M-1s-1 und AtzB_Hom_Pleo N165I C213S Q214S N217I übertraf mit 3.0e5 M-1s-1 sogar das wildtypische AtzB Enzym. Die beiden Homologen von AtzB sind somit plausible Ausgangspunkte für die Evolution alternativer AtzB Enzyme.
HPLC-basierte Analysen der Produktzusammensetzung der Hydrolyse von Hydroxyatrazin durch verschiedene Enzymvarianten zeigte, dass das Vorhandensein einer Serin-Dyade (S218 S219 in AtzB) notwendig und hinreichend für die spezifische Orientierung des Substrates ist, die zur Hydroxyatrazin-Ethylaminohydrolyse führt.
Weiterhin konnte jüngst gezeigt werden, dass AtzB und AtzB_Hom_Pleo eine bisher unbekannte N2,N2-Dimethylguanin-Dimethylaminohydrolaseaktivität besitzen. Diese ist möglicherweise die eigentliche enzymatische Aktivität des Vorläufers von AtzB.
Metadata last modified: 02 Dec 2024 12:57
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