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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-536945
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.53694
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 1 März 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Richard Warth und Prof. Dr. Rainer Schreiber und Dr. Björn Buchhol und Prof. Dr. Christine Ziegler und Prof. Dr. Charlote Wagner |
| Tag der Prüfung: | 30 Januar 2023 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Physiologie Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Stichwörter / Keywords: | Ion channels, Calcium signaling, Kidney disease |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 53694 |
Zusammenfassung (Englisch)
Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is characterized by the development of bilateral cysts, which grow over many years and compromise the function of adjacent renal tissue, leading to a gradual decline in kidney function and ultimately, renal failure. ADPKD is induced by mutations in two different genes, namely PKD1 and PKD2 While PKD1 encodes an orphan receptor (polycystin-1; ...
Zusammenfassung (Englisch)
Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is characterized by the development of bilateral cysts, which grow over many years and compromise the function of adjacent renal tissue, leading to a gradual decline in kidney function and ultimately, renal failure. ADPKD is induced by mutations in two different genes, namely PKD1 and PKD2 While PKD1 encodes an orphan receptor (polycystin-1; PC-1), Pkd2 encodes a non selective cation channel which is permeable for Ca2+ (polycystin-2; PC-2). PC-1 and PC-2 form a functional complex which modulates intracellular calcium. Cyst development and growth in ADPKD are driven by enhanced cell proliferation and chloride secretion. The calcium (Ca2+) activated chloride
channel TMEM16A (Anoctamin 1) was shown to be central in interrupting Ca2+ signaling, and increasing proliferation and Cl- secretion in mice with ADPKD, caused by lack of expression of PC-1. It was unclear whether lack of expression of PC-2 leads to a similar increase of TMEM16A-dependent Ca2+ signaling as does the lack of PC-1 expression. In the present work we demonstrate that the loss of both Pkd1 or Pkd2 leads to enhanced release of Ca2+ from the endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ store, upon purinergic stimulation by ATP. Abnormal Ca2+ signaling due to abrogation of either PC-1 or PC-2 relies on expression of TMEM16A, as demonstrated by siRNA-mediated knockout of TMEM16A. In numerous previous in vitro studies, upregulation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an adenosine 3',5'-cyclic monophosphate (cAMP)-activated chloride channel, was proposed to be crucial for ADPKD. However, this has never been
confirmed in vivo. Using double knockout mice (Pkd1-/-/Cftr-/-), we provide strong evidence that CFTR is not required for cyst development in Pkd1-knockout mice. ADPKD mice lacking expression of CFTR still demonstrate upregulation of ion currents and cell proliferation, and develop large renal cysts, supporting the use of inhibitors for TMEM16A but not CFTR for the treatment of ADPKD. Men develop a more severe ADPKD phenotype compared to women, and have an earlier onset of end stage renal disease (ESRD). Consistently, male gender was shown to be associated with a more severe cyst development in different experimental settings. This gender-dependent disease progression is thought to originate from the differences in sex hormones. We therefore investigated the mechanisms by which androgens and estrogens contribute to differences in disease severity, and whether this mechanism involve TMEM16A. We found that differences in male vs. female ADPKD are paralleled by differences in intracellular Ca2+ signaling, and that androgen-induced upregulation of Ca2+ influx channels is probably the cause for enhanced activity of TMEM16A, and the more severe disease phenotype observed in males.Calmodulin (CAM) is a mediator of intracellular Ca2+ signaling and contradicting reports exist on CAM-dependent regulation of TMEM16A. CAM is a highly conserved Ca2+-binding
messenger which is known to modulate the activity of a wide range of proteins. We indeed found that CAM induced activation of TMEM16A, when TMEM16A was overexpressed, while cells, which express TMEM16A endogenously, do not show a CAM-dependent regulation of TMEM16A. We found evidence that CAM interaction with TMEM16A modulates the Ca2+
sensitivity of TMEM16A. Enhanced Ca2+ sensitivity of overexpressed TMEM16A explains its enhanced activity at basal intracellular Ca2+ levels. These results correspond well to a recent report demonstrating pre-association of CAM with TMEM16A, which mediates sensitization of TMEM16A towards intracellular Ca2+. We therefore propose that regulatory properties of TMEM16A detected in overexpression studies, should be validated for endogenously expressed TMEM16A. In an earlier report, our team demonstrated that the TMEM16A paralogue TMEM16J also
modulates calcium signaling by depleting the (ER) Ca2+ store. Interestingly, the TMEM16J gene is located in a genomic region that negatively regulates immune responses. Mutations within this locus are linked to hyper-inflammatory diseases in various organs and rejection of renal grafts. The function of TMEM16J in immune cells and tissues is currently unknown. A genome wide association study identified a TMEM16J variant, TMEM16J-T604A, as a risk factor for chronic kidney disease (CKD). We found that TMEM16J is an ER-resident ion channel which regulates Ca2+ signaling, while its ion channel function is disrupted in TMEM16J-T604A. Moreover, we demonstrated that TMEM16J and TMEM16J-T604A modulate synthesis and
release of pro-inflammatory cytokines through regulation of intracellular Ca2+ signals, thereby providing a possible link to chronic inflammation and CKD. These results identify TMEM16J as a novel promising target for the treatment of CKD and chronic inflammation in general.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) ist durch die Entwicklung bilateraler Zysten gekennzeichnet, die über viele Jahre hinweg wachsen und die Funktion des angrenzenden Nierengewebes beeinträchtigen. Dies führt zu einer allmählichen Abnahme der Nierenfunktion und schließlich zum Nierenversagen. ADPKD wird durch Mutationen in zwei verschiedenen Genen, nämlich PKD1 und PKD2 ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) ist durch die Entwicklung bilateraler Zysten gekennzeichnet, die über viele Jahre hinweg wachsen und die Funktion des angrenzenden Nierengewebes beeinträchtigen. Dies führt zu einer allmählichen Abnahme der Nierenfunktion und schließlich zum Nierenversagen. ADPKD wird durch Mutationen in zwei verschiedenen Genen, nämlich PKD1 und PKD2 ausgelöst. Während PKD1 für einen Orphan-Rezeptor (Polycystin-1; PC-1) kodiert, kodiert PKD2 für einen nicht-selektiven Kationenkanal, der Ca2+ durchlässig ist (Polycystin-2; PC-2). PC-1 und PC-2 bilden einen funktionellen Komplex, der das intrazelluläre Kalzium moduliert. Zystenentwicklung und -wachstum bei ADPKD werden durch verstärkte Zellproliferation und Chloridsekretion angetrieben. Es konnte bei ADPKD- Mäusen gezeigt werden, dass aufgrund der fehlenden Expression von PC-1 der Kalzium (Ca2+) aktivierte Chloridkanal TMEM16A (Anoctamin 1) eine zentrale Rolle bei der Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Signals, und der Zunahme der Proliferation und Chlorid-Sekretion spielt. Es war unklar, ob eine fehlende Expression von PC-2 zu einem ähnlichen Anstieg des TMEM16A-abhängigen intrazellulären Ca2+-Signals führt, wie das Fehlen der Expression von PC-1. In der vorliegenden Arbeit konnten wir zeigen, dass bei purinerger ATP- Stimulation der Verlust sowohl von Pkd-1 als auch der von Pkd-2 zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+ aus dem Ca2+-Speicher des endoplasmatischen Retikulums (ER) führt. Dieses erhöhte intrazelluläre Ca2+-Signal hängt von der Expression von TMEM16A ab, wie durch siRNA-vermittelte Ausschaltung von TMEM16A gezeigt werden konnte.
In zahlreichen früheren in vitro-Studien wurde eine erhöhte Expression von CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), eines durch Adenosin-3',5'-zyklisches Monophosphat (cAMP) aktivierten Chloridkanals, als entscheidend für Entstehung von ADPKD angesehen. Dies wurde jedoch nie in vivo bestätigt. Mit Hilfe von Doppel-Knockout-Mäusen (Pkd1-/-/Cftr-/-) konnten wir eindeutig nachweisen, dass CFTR für die Zystenbildung bei Pkd-1-Knockout-Mäusen nicht erforderlich ist. ADPKD-Mäuse, denen die Expression von CFTR fehlt, zeigen immer noch erhöhte Ionenströme und eine erhöhte Zellproliferation und entwickeln große Nierenzysten. Diese Ergebnisse unterstützen den Einsatz von TMEM16A- Inhibitoren gegenüber CFTR- Inhibitoren zur Behandlung von ADPKD.
Männer entwickeln einen schwereren ADPKD-Phänotyp als Frauen und weisen ein früheres Auftreten von Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD) auf. Übereinstimmend wurde gezeigt, dass das männliche Geschlecht in verschiedenen Versuchsanordnungen mit einer schwereren Zystenentwicklung verbunden ist. Es wird angenommen, dass dieser geschlechtsabhängige Krankheitsverlauf auf die Geschlechtshormone zurückzuführen ist. Wir untersuchten daher die Mechanismen, durch die Androgene und Östrogene zu den Unterschieden in der Schwere der Erkrankung beitragen, und ob diese Mechanismen TMEM16A betreffen. Wir fanden heraus, dass die Unterschiede zwischen männlicher und weiblicher ADPKD mit Unterschieden im intrazellulären Ca2+-Signal einhergehen und dass wahrscheinlich eine androgen bedingte Hochregulierung von Ca2+-Einstromkanälen die Ursache für die erhöhte Aktivität von TMEM16A ist und die beobachteten schwereren Krankheitsverläufen bei Männern erklärt.
Calmodulin (CAM) ist ein Vermittler des intrazellulären Ca2+-Signals. Es gibt widersprüchliche Berichte über die CAM-abhängige Regulierung von TMEM16A. CAM ist ein hoch konservierter Ca2+-bindender Botenstoff, von dem bekannt ist, dass er die Aktivität einer Vielzahl von Proteinen moduliert. In der Tat haben wir festgestellt, dass CAM die Aktivierung von TMEM16A induziert, wenn TMEM16A überexprimiert wird, während Zellen, die TMEM16A endogen exprimieren, keine CAM-abhängige Regulation von TMEM16A zeigen. Wir fanden Hinweise darauf, dass die Interaktion von CAM mit TMEM16A die Ca2+-Empfindlichkeit von TMEM16A moduliert. Die erhöhte Ca2+-Empfindlichkeit von überexprimiertem TMEM16A erklärt seine erhöhte Aktivität bei basalen intrazellulären Ca2+-Spiegeln. Diese Ergebnisse stimmen gut mit einem kürzlich erschienenen Bericht über die Interaktion von CAM mit TMEM16A überein, die eine Sensibilisierung von TMEM16A gegenüber intrazellulärem Ca2+ bewirkt. Wir empfehlen deshalb, dass die regulatorischen Eigenschaften von TMEM16A, die in Überexpressionsstudien nachgewiesen wurden, für endogen exprimiertes TMEM16A validiert werden sollten.
In einer früheren Veröffentlichung hat unser Team gezeigt, dass der TMEM16A-Paralog TMEM16J auch das intrazellulären Ca2+-Signal moduliert, indem er den Ca2+-Speicher des endoplasmatischen Retikulums (ER) leert. Interessanterweise befindet sich das TMEM16J-Gen in einer genomischen Region, die die Immunantwort negativ reguliert. Mutationen innerhalb dieses Lokus werden mit hyperinflammatorischen Erkrankungen in verschiedenen Organen und der Abstoßung von Nierentransplantaten in Verbindung gebracht. Die Funktion von TMEM16J in Immunzellen und -geweben ist derzeit noch unbekannt. In einer genomweiten Assoziationsstudie wurde eine TMEM16J-Variante, TMEM16J-T604A, als Risikofaktor für chronische Nierenerkrankungen (CKD) identifiziert. Wir fanden heraus, dass TMEM16J ein im ER ansässiger Ionenkanal ist, der das intrazellulären Ca2+-Signal reguliert. Dagegen ist die Ionen- Kanalfunktion bei TMEM16J-T604A gestört. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass TMEM16J und TMEM16J-T604A die Synthese und Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen durch die Regulierung intrazellulärer Ca2+-Signale modulieren und damit eine mögliche Verbindung zu chronischen Entzündungen und CKD herstellen. Diese Ergebnisse identifizieren TMEM16J als einen neuen, vielversprechenden pharmakologischen Angriffspunkt für die Behandlung von CKD und chronischen Entzündungen.
Metadaten zuletzt geändert: 01 Mrz 2023 07:50
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