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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-537390
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.53739
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 10 Februar 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Christoph Klein |
| Tag der Prüfung: | 8 Februar 2023 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren |
| Stichwörter / Keywords: | Extrazelluläre Vesikel, Malignes Melanom, Immunzellen, Metastasierung, Onkologie |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 53739 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Mehr als 90 Prozent der Krebspatienten sterben an Metastasen, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen der Metastasierung bisher nicht vollständig verstanden sind. Wächterlymphknoten (SLN), welche aufgrund ihrer prognostischen Relevanz im Rahmen der klinischen Diagnostik von Melanompatienten entnommen werden, sind ein leicht zugängliches Gewebe um diese Mechanismen zu studieren, da hier die ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Mehr als 90 Prozent der Krebspatienten sterben an Metastasen, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen der Metastasierung bisher nicht vollständig verstanden sind. Wächterlymphknoten (SLN), welche aufgrund ihrer prognostischen Relevanz im Rahmen der klinischen Diagnostik von Melanompatienten entnommen werden, sind ein leicht zugängliches Gewebe um diese Mechanismen zu studieren, da hier die verschiedenen Stadien der metastatischen Kaskade von einzelnen disseminated cancer cells (DCC) bis hin zu Metastasen gefunden werden können und weil im SLN als sekundäres hämatopoetisches Organ auch die Wechselwirkung mit Immunzellen analysiert werden kann. Im Rahmen von Vorarbeiten der Arbeitsgruppe hatte ein scRNAseq-basierter Trankriptom-vergleich von SLN-DCC vor und während der Kolonisierung ergeben, dass der extrazelluläre Vesikel (EV)-Pathway in den DCC im Zuge der metastatischen Kolonisierung hochreguliert wird. Auch wies eine IFNγ-Signatur in den DCC und die erhöhte Frequenz von s.g. exhausted PD-1+ TIM3+ CD8-T-Zellen bei steigendem Tumorzellbefall des SLN auf einen vorangegangenen Kontakt mit CD8-T-Zellen hin. Diese Beobachtungen führten zu der Hypothese, dass DCC über die Hochregulation des EV-Pathways die Funktionalität der CD8-T-Zellen beeinträchtigen und den Prozess der metastatischen Kolonisierung vorantreiben. Diese Hypothese wurde adressiert, indem (i) der immunmodulatorische Effekt von EVs auf humane CD8-T-Zellen analysiert und daran beteiligte Immuncheckpoint-Liganden (ICL) identifiziert wurden und (ii) untersucht wurde, ob EVs mit miRNA Molekülen beladen sind, welche Funktion und Phänotyp von Antigen Presenting Cells (APCs) und damit auch T-Zellantworten modulieren könnten. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden EVs durch differentielle Ultrazentrifugation aus dem Zellkulturüberstand von vier Melanom-DCC-Zelllinienmodellen (MelDCCs) gewonnen, welche sich aus Patient-Derived Xenografts (PDX) ableiteten. Die Charakterisierung der MelDCC-EVs mittels Western Blot (WB), Transmissionselektronenmikroskopie und Nanoparticle Tracking Analysis belegte die erfolgreiche Isolierung einer homogenen Population von intakten, kleinen EVs definierter Größe. Eine Zugabe von EVs vor und nach polyklonaler Stimulation von humanen CD8-T-Zellen und anschließender multiparametrischer Durchflusszytometrie zeigte einen inhibitorischen Effekt der EVs, da diese die Proliferation und die Differenzierung von CD8-T-Zellen zu IFNγ- und GRZB-produzierenden Effektor-Zellen supprimierten. Mittels Größenausschlusschromatographie und Produktion der EVs in FBS-freiem Medium konnte ausgeschlossen werden, dass die suppressive Aktivität der EVs auf mitisolierte lösliche Proteine zurückzuführen war. Auch konnten durch WB-Analyse der MelDCCs und der davon abstammenden EVs, wie auch der Analyse der scRNAseq Daten von DCC aus SLN die ICL CD155 und CD276 als mögliche Vermittler dieser Effekte identifiziert werden. Die Relevanz von CD155 und CD276 für den immunsuppressiven Effekt der EVs konnte durch CRISPR/Cas9 Knock-out der Moleküle belegt werden. Hinweise für die Bedeutsamkeit der CD155/TIGIT/CD226-Achse lieferte die multi-parametrische durchflusszytometrische Analyse von Lymphknoten aus Melanompatienten, welche zeigte, dass mit ansteigendem Tumorzellbefall des SLN der inhibitorische (TIGIT) über den stimulatorischen (CD226) CD155-Rezeptor auf den CD8-T-Zellen dominierte, was sich auch in der verminderten Fähigkeit der CD8-T-Zellen das Effektor-Zytokin TNF zu exprimieren, widerspiegelte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Behandlung von Melanompatienten im frühen Stadium mit anti-CD155 oder anti-CD276 Antikörpern in Kombination mit anti-PD-1/PD-L1 Antikörpern möglicherweise erfolgsversprechend wäre, um einer Supprimierung von tumorreaktiven CD8-T-Zellen entgegenzuwirken und so die metastatische Kolonisierung des SLN und damit ein Fortschreiten der Krankheit zu stoppen. Darüber hinaus könnten die DCC über ihre EVs auch die Funktion von APCs, wie Makrophagen, beeinflussen, da MelDCC-Linien übergreifend eine Anreicherung von miRNAs mit potenziellem Einfluss auf die Makrophagen-Funktion, wie z.B. miR-21, miR-146a und miR-320, in den EVs nachgewiesen werden konnte. Zukünftige Untersuchungen werden zeigen, ob die Beeinflussung von APCs durch DCC-EVs einen weiteren Mechanismus darstellt, mit dem DCC ihre Immunmikroumgebung modulieren und ihr Auswachsen zur Metastase vorantreiben können.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
More than 90 percent of cancer patients die from metastases, but the underlying mechanisms of metastasis are not yet fully understood. Sentinel lymph nodes (SLN), which are removed from melanoma patients due to their prognostic relevance in clinical diagnostics, are an easily accessible tissue to study these mechanisms. Here not only the different stages of the metastatic cascade from single ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
More than 90 percent of cancer patients die from metastases, but the underlying mechanisms of metastasis are not yet fully understood. Sentinel lymph nodes (SLN), which are removed from melanoma patients due to their prognostic relevance in clinical diagnostics, are an easily accessible tissue to study these mechanisms. Here not only the different stages of the metastatic cascade from single disseminated cancer cells (DCC) to metastases can be found, but also the interaction with immune cells can be analyzed within the SLN as it is a secondary hematopoietic organ. As part of preliminary work by the group, a scRNAseq-based transcriptome analysis of SLN-DCC before and during colonization revealed that the extracellular vesicle (EV) pathway is upregulated in DCC during metastatic colonization. Also, an IFNγ signature in the DCC and the increased frequency of so-called exhausted PD-1+ TIM3+ CD8 T cells with increasing tumor cell load of the SLN indicated previous contact with CD8 T cells. These observations led to the hypothesis that DCC impair CD8 T cell functionality via upregulation of the EV pathway and drive the process of metastatic colonization. This hypothesis was addressed by (i) analyzing the immunomodulatory effect of EVs on human CD8 T cells and identifying immune checkpoint ligands (ICLs) involved and (ii) investigating whether EVs are loaded with miRNA molecules that could modulate the function and phenotype of antigen-presenting cells (APCs) and thus T cell responses. To investigate this hypothesis, EVs were obtained by differential ultracentrifugation from the cell culture supernatant of four melanoma DCC cell line models (MelDCCs) generated out of patient-derived xenografts (PDX). Characterization of MelDCC-EVs by Western blot (WB), transmission electron microscopy, and nanoparticle tracking analysis demonstrated the successful isolation of a homogeneous population of intact, small EVs of defined size. The addition of EVs before and after polyclonal stimulation of human CD8 T cells followed by multiparametric flow cytometry revealed an inhibitory effect of EVs as they suppressed the proliferation and differentiation of CD8 T cells into IFNγ- and GRZB-producing effector cells. Size exclusion chromatography and production of EVs in FBS-free medium excluded that co-isolated soluble proteins caused the suppressive activity of EVs. Also, WB analysis of MelDCCs and EVs derived from them, as well as analysis of scRNAseq data of DCC from SLN, identified ICL CD155 and CD276 as possible mediators of these effects. The relevance of CD155 and CD276 for the immunosuppressive effect of EVs was demonstrated by CRISPR/Cas9 knockout of the molecules. Evidence for the importance of the CD155/TIGIT/CD226 axis was provided by multi-parametric flow cytometric analysis of lymph nodes from melanoma patients. It showed that with increasing tumor cell load of the SLN, the inhibitory (TIGIT) dominated over the stimulatory (CD226) CD155 receptor on CD8 T cells, which was also reflected in the decreased ability of CD8 T cells to express the effector cytokine TNF. These results suggest that treatment of early-stage melanoma patients with anti-CD155 or anti-CD276 antibodies in combination with anti-PD-1/PD-L1 therapy might be promising to counteract suppression of tumor-reactive CD8 T cells and thereby stop metastatic colonization of the SLN and thus disease progression. In addition, DCCs might also affect the function of APCs, such as macrophages, via their EVs, as MelDCC lines have been shown to accumulate miRNAs with potential impact on macrophage function, such as miR-21, miR-146a, and miR-320, in EVs across lines. Future studies will reveal whether the manipulation of APCs by DCC-EVs represents another mechanism by which DCC can modulate their immune microenvironment and drive their outgrowth to metastasis.
Metadaten zuletzt geändert: 10 Feb 2025 07:58
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