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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-539236
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.53923
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 17 März 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Stefan Wagner |
| Tag der Prüfung: | 28 Februar 2023 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Innere Medizin II |
| Stichwörter / Keywords: | Ca/Calmodulin-abhängige Kinase II; CaMKII; SR-Kalziumleck; CaMKII-Inhibition |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 53923 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Ca/Calmodulin-abhängige Kinase II spielt eine zentrale Rolle im Kalziumzyklus des Kardiomyozyten im Rahmen der elektromechanischen Koppelung. Sie vermag verschiedene regulatorische Proteine wie den Ryanodinrezeptor des SR, den L-Typ-Kalziumkanal und Phospholamban zu phosphorylieren und zu aktivieren. Im Zuge der Herzinsuffizienz kommt es, etwa sympathikus- oder RAAS-abhängig zu einer ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Ca/Calmodulin-abhängige Kinase II spielt eine zentrale Rolle im Kalziumzyklus des Kardiomyozyten im Rahmen der elektromechanischen Koppelung. Sie vermag verschiedene regulatorische Proteine wie den Ryanodinrezeptor des SR, den L-Typ-Kalziumkanal und Phospholamban zu phosphorylieren und zu aktivieren. Im Zuge der Herzinsuffizienz kommt es, etwa sympathikus- oder RAAS-abhängig zu einer Hochregulation der CaMKII, was Veränderungen im Kalziumzyklus der Zelle nach sich zieht. Diese führen schließlich zu einer Zunahme des diastolischen SR-Kalziumlecks und zum vermehrten Auftreten von Kalziumsparks, spontaner Kalziumfreisetzungsereignisse der Ryanodinrezeptoren mit arrhythmogenem Potenzial.
Die resultierende Abnahme des SR-Kalziumgehalts und Zunahme der diastolischen sarkoplasmatischen Kalziumkonzentration der Zelle führen zu einer Beeinträchtigung von Kontraktilität und Relaxationsfähigkeit der Herzmuskelzelle und fördern die Entstehung von Nachdepolarisationen, denen ein entscheidender pathophysiologischer Beitrag zur Auslösung und Aufrechterhaltung von Arrhythmien zugeschrieben wird.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Wirkung der beiden neuartigen CaMKII-Inhibitoren RA654321 und GS-680. Die Hypothese besagte, dass sie durch Hemmung der Enzymaktivität zu einer Reduktion der Kalziumsparkfrequenz und des diastolischen SR-Kalziumlecks sowie zu einer Zunahme des SR-Kalziumgehalts führen sollen.
Die Auswirkungen von RA654321 wurden in Herzmuskelzellen von Mäusen untersucht, die durch retrograden enzymatischen Verdau des Myokards über die Koronargefäße gewonnen wurden. Im Vorfeld wurde die Mäusekohorte unterteilt. Je zur Hälfte durchliefen die Tiere eine TAC-Operation zur Induktion einer Herzinsuffizienz und eine Sham-Operation, welche die Kontrollgruppe darstellte. Innerhalb dieser beiden Gruppen wurde wiederum jeweils einem Teil der Tiere RA654321 bereits in vivo verabreicht, sodass auch ein möglicher längerfristiger Effekt untersucht werden konnte. Um mögliche Veränderungen in vivo zu erfassen, erhielten die Tiere echokardiographische Verlaufsuntersuchungen vor der Operation, vor Beginn der Behandlung mit RA654321 in vivo und vor der Zellisolation am Ende des vierwöchigen Beobachtungszeitraums. Nach der Isolation wurden die Zellen mit dem kalziumbindenden Farbstoff Fluo-4, AM inkubiert und schließlich konfokalmikroskopisch untersucht.
Die echokardiographischen Ergebnisse zeigten signifikant auf, dass das Herzinsuffizienzmodell nach TAC funktioniert und sich eine Abnahme der linksventrikulären EF, eine myokardiale Hypertrophie und schließlich auch Dilatation eingestellt hatte. Zudem war ersichtlich, dass RA654321 in vivo die Progredienz der Herzinsuffizienz zu verhindern vermochte.
Dennoch fielen die Ergebnisse der konfokalen Kalziummessungen heterogen und divergierend aus. Die eindeutigen Veränderungen, die das TAC-Modell in vivo hervorgerufen hatte, konnten in vitro anhand der erhobenen Parameter nicht reproduziert werden. Weiterhin fand sich auch weder nach Applikation von RA654321 in vivo noch nach der Inkubation in vitro ein einheitlicher Trend. Da diese Ergebnisse im Kontrast zu den echokardiographischen Daten in vivo stehen und auch unter AIP kein Effekt in den konfokalen Messungen erkennbar war, wurde die in vitro angewandte Methodik kritisch hinterfragt. Eine Aussage über die Wirksamkeit des Inhibitors war letztlich auch aufgrund der eingeschränkten statistischen Wertigkeit der Daten nicht möglich.
Weiterhin erfolgte die Testung von RA654321 und zusätzlich auch eines zweiten CaMKII-Inhibitors, GS-680, in humanem rechtsatrialem Myokard. Das Gewebe entstammte dem rechten Vorhofohr und wurde bei der Kanülierung im Rahmen von Herzoperationen mit extrakorporaler Zirkulation reseziert. Nach enzymatischem und mechanischem Verdau mittels „Chunk Isolation“ wurden die Zellen nach Inkubation mit Fluo-4, AM und den beiden CaMKII-Inhibitoren in verschiedenen Konzentrationen wiederum konfokalmikroskopisch analysiert.
Es zeigte sich hier, dass beide CaMKII-Inhibitoren zu einer signifikanten Reduktion der Sparkfrequenz sowie einer deutlichen Abnahme des diastolischen SR-Kalziumlecks führten. Weiterhin nahm der SR-Kalziumgehalt tendenziell zu. Diese Entwicklungen entsprechen den formulierten Erwartungen und decken sich auch mit den Ergebnissen des eingesetzten Referenzinhibitors AIP.
Dadurch konnte die „Leak-Load Relationship“, also die Hypothese, dass das SR-Kalziumleck mit zunehmendem SR-Kalziumgehalt ebenfalls ansteigt, ausgehebelt und die Wirksamkeit der Inhibition unterstrichen werden.
Abschließend blieb festzustellen, dass trotz ausgiebiger Erforschung der physiologischen und pathophysiologischen Grundlagen der CaMKII das Prinzip ihrer Inhibition noch immer nicht den Sprung in die klinische Herzinsuffizienztherapie vollziehen konnte. Dennoch scheint der Ansatz vielversprechend. Die etablierten Pharmaka agieren insbesondere im Bereich der hochregulierten neurohumoralen Systeme, während der Bereich des elektrophysiologischen Remodelings bislang nur peripher tangiert wird. Die Chance der CaMKII-Inhibitoren besteht daher in ihrem zentralen Angriffspunkt im Kalziumzyklus des Kardiomyozyten und ihrem daraus erwachsenden Potenzial, die pharmakologische Therapie der Herzinsuffizienz um dieses Feld zu erweitern.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Ca/calmodulin-dependent Kinase II is a central player in myocardial calcium cycling during excitation contraction coupling. It is capable of phosphorylating and activating various regulatory proteins such as the SR ryanodine receptor, the L-type calcium channel and Phospholamban. In the course of heart failure, upregulation of CaMKII occurs, e.g. induced by the sympathetic nervous system or the ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Ca/calmodulin-dependent Kinase II is a central player in myocardial calcium cycling during excitation contraction coupling. It is capable of phosphorylating and activating various regulatory proteins such as the SR ryanodine receptor, the L-type calcium channel and Phospholamban. In the course of heart failure, upregulation of CaMKII occurs, e.g. induced by the sympathetic nervous system or the renin-angiotensin-aldosterone-system, leading to changes in cellular calcium cycling. These eventually result in an increased SR calcium leak and occurrence of calcium sparks being spontaneous potentially arrhythmogenic SR calcium release events.
The resulting decrease in SR calcium content and increase in diastolic sarcoplasmic calcium levels lead to impaired contractility and relaxability of the cardiomyocyte and promote the development of afterdepolarizations which are attributed a decisive pathophysiological contribution to the initiation and maintenance of arrhythmias.
The subject of the present thesis is the effect of the two novel CaMKII inhibitors RA654321 and GS-680. It was hypothesized that inhibition of enzyme activity should lead to reduced calcium spark frequency and diastolic SR calcium leak as well as increased SR calcium levels.
The effects of RA654321 were studied in murine cardiomyocytes obtained by retrograde enzymatic digestion of the myocardium via the coronary system. The mouse cohort was subdivided in advance. Half each of the animals underwent TAC procedure to induce heart failure and sham surgery representing the control group. Within these two groups part of the animals received RA654321 in vivo for investigation of a possible long-term effect. To assess possible changes in vivo, echocardiographic follow-up studies were done before surgery, before starting treatment with RA654321 in vivo and before cell isolation at the end of the four-week observation period. After isolation cells were incubated with the calcium-binding dye Fluo-4, AM and finally examined using a confocal microscope.
The echocardiographic results significantly proved successful induction of the heart failure model by TAC, showing a decrease in left ventricular EF as well as onset of myocardial hypertrophy and finally also dilatation. It was also evident that RA654321 was able to prevent the progress of heart failure in vivo.
Nevertheless, the results of the confocal calcium measurements were heterogeneous and divergent. The clear changes caused by the TAC model in vivo could not be reproduced in vitro using the parameters collected. Additionally, no uniform trend was observed after application of RA654321 in vivo nor after incubation in vitro. Since these results are in contrast to the echocardiographic data in vivo and no effect was recognizable in the confocal measurements, even under AIP, in vitro methods were critically reviewed. A statement about the effectiveness of the inhibitor was ultimately not possible due to the limited statistical value of the data.
Furthermore, RA654321 and a second CaMKII inhibitor, GS-680, were tested in human right atrial myocardium. The tissue originated from the right atrial appendage and was acquired at the point of cannulation during cardiac surgery with extracorporeal circulation. Following enzymatic and mechanical digestion using chunk isolation, the cells were again analyzed by confocal microscopy after incubation with Fluo-4, AM and the two CaMKII inhibitors in different concentrations.
Both CaMKII inhibitors turned out to cause a significant reduction in spark frequency and a clear decrease in diastolic SR calcium leak. Moreover, SR calcium content tended to increase. These developments correspond to the stated expectations as well as to the results of the reference inhibitor AIP.
This negated the leak-load relationship, i.e. the hypothesis that the SR calcium leak also increases with increasing SR calcium content, and underlined the effectiveness of the inhibition.
In conclusion, it remained to be stated that despite extensive research on physiology and pathophysiology of CaMKII, the principle of its inhibition has still not made the leap into clinical heart failure therapy. Nevertheless, the approach seems promising. The established pharmaceuticals act in particular in the area of the highly regulated neurohumoral systems, while the area of electrophysiological remodeling has only been peripherally affected so far. The opportunity of CaMKII inhibitors therefore consists in their central point of attack in the myocardial calcium cycle and their potential arising thereof to enhance the pharmacological therapy of heart failure by this field.
Metadaten zuletzt geändert: 17 Mrz 2023 05:37
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