Untersuchung der Migrations- und Adhäsionsfähigkeit von CLN7-knockout Zellen

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-541332
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.54133

Lorenz, Sebastian

License: Creative Commons Attribution 4.0
PDF
(6MB)

Date of publication of this fulltext: 25 May 2023 07:44

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	25 May 2023
Referee:	PD Dr. Markus Reichold
Date of exam:	26 April 2023
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Richard Warth
Keywords:	CLN7, Neuronale Ceroidlipofusziose, Lysosomen, Zellmigration, Zelladhäsion
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	54133

Preview

Export bibliographical data

Abstract (German)

Abstract (German)

Grundlage für die vorliegenden Experimente waren Vorversuche, welche eine Beteiligung des CLN7/MFSD8-Genproduktes an der Zellmigration sowie der Zelladhäsion vermuten ließen.
Deshalb wurde ein Konzept ausgearbeitet, diese Zellfunktionen vergleichend zu untersuchen. Primär konnten die Ergebnisse der Vorversuche mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion auf mRNA der regulierten Gene bestätigt werden.
Zur Untersuchung der Zellmigration wurde ein sogenannter Neurosphere-Migrationsassay etabliert, bei welchem Zellen in Zellkugeln angesät wurden und danach auf verschiedenen Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) kreisförmig auswachsen konnten. Hier zeigte sich ein deutlicher Unterschied in der Wachstumsgeschwindigkeit. CLN7-WT-Zellen wuchsen auf nahezu allen untersuchten ECM-Untergründen signifikant schneller aus als verschiedene Knockout-Varianten. Um problematische Fehlerquellen bei der Interpretation der Flächenzunahme im Migrationsassay auszuschliessen, erfolgte im Folgenden eine elektronisch basierte Zellzählung und Volumenmessung. Hier wurde die Proliferationsgeschwindigkeit der untersuchten Zellsysteme bestimmt, wobei sich in der für die Experimente relevante Zeitspanne keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich Zellproliferation sowie -volumen zeigten und somit diesbezüglich keine Beeinflussung der Ergebnisse der übrigen Experimente anzunehmen war. Weiterhin wurden verschiedene Untersuchungen zur Adhäsionsstärke/-fähigkeit durchgeführt. Hierbei zeigte sich nach Anlage eines Flüssigkeitsstroms zur Ausübung einer Scherkraft auf den Zellrasen, dass Wildtyp-Zellen deutlich stärker an einer mit Fibronectin beschichteten Oberfläche hafteten als Knockout-Varianten. Auch zeigte sich hier eine differente Ablösekinetik auf Grund einer möglicherweise unterschiedlich ausgeprägten Zell-Zell-Haftung. Zuletzt wurden vergleichende (Immun)fluoreszenzfärbungen verschiedener Komponenten des Zytoskelettes und der Integrin β1-Untereinheit angefertigt. Diese konnten keinen deutlichen visuellen Unterschied bezüglich der Verteilung als auch der Ausprägung der untersuchten Zellkomponenten erbringen. Nach Zusammenschau aller Daten lässt sich festhalten, dass CLN7- Wildtypzellen im Vergleich zu Knockout-Varianten eine deutlich bessere Migrations- sowie Adhäsionsfähigkeit besitzen.

Translation of the abstract (English)

The basis for the present experiments were preliminary experiments, which suggested an involvement of the CLN7/MFSD8 gene product in cell migration as well as cell adhesion.
Therefore, a concept was elaborated to investigate these cell functions comparatively. Primarily, the results of the preliminary experiments could be confirmed by quantitative polymerase chain reaction on mRNA of the regulated genes.
To investigate cell migration, a so-called neurosphere migration assay was established, in which cells were seeded in cell spheres and then allowed to grow out in a circle on various proteins of the extracellular matrix (ECM). This showed a clear difference in growth rate. CLN7-WT cells grew out significantly faster than different knockout variants on almost all ECM substrates examined. To eliminate problematic sources of error in the interpretation of area increase in the migration assay, an electronically based cell counting and volume measurement was performed in the following. Here, the proliferation rate of the investigated cell systems was determined, whereby no significant differences with regard to cell proliferation as well as cell volume were found in the time span relevant for the experiments and thus no influence on the results of the other experiments could be assumed in this respect. Furthermore, various tests were carried out on the adhesion strength/capability. After application of a liquid flow to exert a shear force on the cell lawn, it was found that wild-type cells adhered significantly more strongly to a surface coated with fibronectin than knockout variants. This also revealed differential detachment kinetics due to a possible difference in cell-cell adhesion. Last, comparative (immuno)fluorescence stainings of different components of the cytoskeleton and integrin β1-subunit were made. These could not yield a clear visual difference with respect to the distribution as well as the expression of the examined cell components. After summarizing all data, it can be concluded that CLN7 wild-type cells have a significantly better migration as well as adhesion ability compared to knockout variants.

Owner only: item control page

Download Statistics

More literature (via CORE)

Details

Preview

Export bibliographical data

Abstract (German)

Abstract (German)

Translation of the abstract (English)

Translation of the abstract (English)

Download Statistics

Downloads

More literature (via CORE)

University Library