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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-541827
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.54182
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 May 2023 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 14 April 2023 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | CRISPR/Cas9, M. Best, Haplotypen |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 54182 |
Abstract (German)
Bei der Best`schen vitelliformen Makuladystrophie (BVMD) oder auch Morbus Best (M. Best) handelt es sich um eine autosomal dominant vererbte Makulopathie, von der primär die Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) betroffen sind. Bis heute sind mehr als 200 verschiedene Mutationen im Bestrophin 1 (BEST1) Gen bekannt, welche zu einer Funktionsbeeinträchtigung des BEST1 Proteins als ...
Abstract (German)
Bei der Best`schen vitelliformen Makuladystrophie (BVMD) oder auch Morbus Best (M. Best) handelt es sich um eine autosomal dominant vererbte Makulopathie, von der primär die Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) betroffen sind. Bis heute sind mehr als 200 verschiedene Mutationen im Bestrophin 1 (BEST1) Gen bekannt, welche zu einer Funktionsbeeinträchtigung des BEST1 Proteins als Volumen-gesteuerter Kalzium-abhängiger Chlorid-Kanal in der basolateralen Membran der RPE Zellen führen. BVMD-assoziierte Mutationen üben einen dominant negativen Effekt auf das wildtypische Allel aus. Vermutlich führt schon der Einbau einer einzigen mutierten Proteinuntereinheit in die homo-pentamere BEST1 Kanalstruktur zu einer Beeinträchtigung des Chloridtransports. Der therapeutische Ansatz dieser Arbeit zielt daher auf eine Reduktion mutierter Untereinheiten auf genomischer Ebene ab, welcher als mutationsunabhängiger Ansatz über die CRISPR/Cas9 Methode verfolgt werden soll. Anstatt der jeweils Krankheits-verursachenden Mutation, werden häufig vorkommende Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) am BEST1-Genort targetiert, die sich in cis auf dem Mutations-tragenden DNA-Strang befinden. Dafür wurden zunächst bioinformatisch SNP-spezifische single guide RNAs (sgRNAs) entworfen. Für die Erkennung der DNA durch den CRISPR/Cas-Komplex ist eine kurze Basensequenz in der DNA, die sogenannte Protospacer Adjacent Motiv (PAM) Sequenz notwendig. Indem die sgRNA an die komplementäre Ziel-DNA bindet, wird die Cas9-Endonuklease spezifisch an den mutationstragenden Haplotypen herangeführt, wo dieser Komplex Doppelstrangbrüche (DSB) verursacht. Durch die Fehleranfälligkeit der nicht-homologen Endreparatur (non-homologous end joining, NHEJ) entstehen Insertionen und Deletionen, die zu der Entstehung frühzeitiger Stopcodons und zu einem Abbruch der Gentranslation führen. Das Wildtyp-Allel, welches sich an der Position des SNPs von dem mutierten Allel unterscheidet, sollte von der Mutations-abhängigen sgRNA nicht beeinflusst werden. Dadurch sollte weiterhin funktionsfähiges Protein exprimiert werden, wenn auch nur haploinsuffizient. Damit sollte wieder ein funktionsfähiger pentamerer BEST1-Chloridkanal generiert werden.
Für die Allel-spezifische Genomeditierung wurden zunächst Transfektionsexperimente in HEK293T-Zellen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die experimentellen Evidenzen nur ungenügend mit den durch die Software errechneten Vorhersagewerten für eine hohe Effizienz und Spezifität der sgRNAs übereinstimmten. Daher wurde die Allelspezifität der sgRNAs mittels Sequenzverkürzungen und dem Austausch einzelner Nukleotide in der sgRNA-Sequenz entgegen zu wirken. Dieser Optimierungsprozess konnte für alle untersuchten sgRNAs eine deutliche Verbesserung der Allelspezifität erreichen. Dabei konnte festgestellt werden, dass Modifikationen am 5`-Ende der sgRNA deutlich besser toleriert werden als in den zur PAM-Sequenz angrenzenden 8-12 Nukleotiden einer sgRNA, der sogenannten „Seed“-Region. Allerdings gelang es trotz zahlreicher Versuche nicht, allgemein gültige Aussagen über den Erfolg der Optimierungsansätze zu treffen, da abhängig von der Ziel- und sgRNA-Sequenz jeweils unterschiedliche Modifikationen zum optimalen Ergebnis führten. In einem finalen Schritt wurde das Ausmaß der tatsächlich stattgefundenen Haplotypdeletionen in primären Fibroblasten-Zelllinien an definierten Haplotypen von BVMD-Patienten getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die optimierten sgRNAs an den heterozygoten Genloci eine durchweg sehr gute Spezifität für den mutationstragenden DNA-Strang zeigten. Entsprechend wurde das wildtypische Allel in keinem der untersuchten Fälle vom CRISPR/Cas9-System erkannt und modifiziert. Allerdings waren die Effizienzen der sgRNAs, DSBs in der Ziel-DNA zu erzeugen, sehr unterschiedlich und korrelierten selten mit den bioinformatischen Berechnungen oder den Vorexperimenten in den HEK293T-Zellen. Für eine genaue Bestimmung der Effizienzen war daher die jeweilige experimentelle Austestung der einzelnen sgRNAs und/oder deren Kombination in den Patienten-Fibroblasten-Zelllinien erforderlich.
Translation of the abstract (English)
Best's vitelliform macular dystrophy (BVMD) or Best's disease (M. Best) is an autosomal dominant inherited maculopathy that primarily affects the cells of the retinal pigment epithelium (RPE). To date, more than 200 different mutations in the bestrophin 1 (BEST1) gene are known, which lead to a functional impairment of the BEST1 protein as a volume-gated calcium-dependent chloride channel in the ...
Translation of the abstract (English)
Best's vitelliform macular dystrophy (BVMD) or Best's disease (M. Best) is an autosomal dominant inherited maculopathy that primarily affects the cells of the retinal pigment epithelium (RPE). To date, more than 200 different mutations in the bestrophin 1 (BEST1) gene are known, which lead to a functional impairment of the BEST1 protein as a volume-gated calcium-dependent chloride channel in the basolateral membrane of the RPE cells. BVMD-associated mutations exert a dominant negative effect on the wild-type allele. The incorporation of a single mutated protein subunit into the homo-pentameric BEST1 channel structure leads to an impaired chloride transport. The therapeutic approach of this work therefore aims at a reduction of mutated subunits at a genomic level, which should be pursued as a mutation-independent approach using the CRISPR/Cas9 method. Instead of targeting the disease-causing mutation, common single nucleotide polymorphisms (SNPs) are targeted at the BEST1 locus, which are in cis on the mutation-carrying DNA strand. First, bioinformatic SNP-specific single guide RNAs (sgRNAs) were designed. A short base sequence in the DNA, the so-called Protospacer Adjacent Motive (PAM) sequence, is necessary for the recognition of the DNA by the CRISPR/Cas complex. By binding of the sgRNA to the complementary target DNA, the Cas9 endonuclease is specifically targeted to the mutation-carrying haplotype, where this complex causes double-strand breaks (DSBs). The error-proneness of the non-homologous end repair (non-homologous end joining, NHEJ) results in insertions and deletions that lead to the formation of premature stop codons and to an abort of gene translation. The wild-type allele, which differs from the mutant allele at the position of the SNP, should not be affected by the mutation-dependent sgRNA. This should continue to express functional protein, albeit haploinsufficiently. This should again generate a functional pentameric BEST1 chloride channel.
For the allele-specific genome editing, transfection experiments were initially carried out in HEK293T cells. It was shown that the experimental evidence only insufficiently matches with the predictive values calculated by the software. Therefore, the allele specificity of the sgRNAs was improved by shortening the sequence and exchanging individual nucleotides in the sgRNA sequence. Through this optimization process it was possible to achieve a significant improvement in allele specificity for all examined sgRNAs. It was found that modifications at the 5' end of the sgRNA are tolerated much better than in the 8-12 nucleotides of an sgRNA adjacent to the PAM sequence, the so-called "seed" region. However, despite numerous attempts, it was not possible to make generally valid statements about the success of the optimization approaches, since different modifications led to the optimal result depending on the target and sgRNA sequence. In a final step, the extent of haplotype deletions that actually occurred in primary fibroblast cell lines was tested on defined haplotypes from BVMD patients. It could be shown that the optimized sgRNAs at the heterozygous gene loci showed consistently very good specificity for the mutation-carrying DNA strand. The wild-type allele was not recognized and modified by the CRISPR/Cas9 system in any of the cases examined. However, the efficiencies of the sgRNAs to generate DSBs in the target DNA were very different and rarely correlated with the bioinformatic calculations or the preliminary experiments in the HEK293T cells. For an exact determination of the efficiencies, the respective experimental testing of the individual sgRNAs and/or their combination in the patient fibroblast cell lines was necessary.
Metadata last modified: 16 May 2023 12:40
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