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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-543089
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.54308
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 1 April 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Antje J. Baeumner |
| Tag der Prüfung: | 10 März 2023 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, ehemals Prof. Wolfbeis) |
| Stichwörter / Keywords: | Chemiluminescence, Point-of-Care Diagnostics, Liposomes |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 54308 |
Zusammenfassung (Englisch)
In the following, different strategies were investigated to improve current POCT concepts to a quantitative diagnostic tool using chemiluminescence for detection. Chemiluminescence (CL) provides outstanding analytical performance due to its independence from external light sources, uniquely suiting quantitative POCT due to minimal instrumental requirements. Furthermore, it is exceptionally ...
Zusammenfassung (Englisch)
In the following, different strategies were investigated to improve current POCT concepts to a quantitative diagnostic tool using chemiluminescence for detection. Chemiluminescence (CL) provides outstanding analytical performance due to its independence from external light sources, uniquely suiting quantitative POCT due to minimal instrumental requirements. Furthermore, it is exceptionally sensitive due to its background-free nature. The initial photophysical characterization of a new luminol derivative, m-carboxy luminol, revealed a 5-time higher quantum yield towards standard luminol and improved water solubility. Changing to this stronger emitting luminophore favored already standard microtiter plate-based assays by improving their sensitivity and limit of detection (LOD). Transferring these findings to a paper-based POCT setup demonstrated the benefit of a simply stronger emitting luminophore in the POCT field as signal recording becomes accessible to ubiquitous available detection devices such as simple smartphones. Specifically, a universal enzymatic microfluidic paper-based analytical device (μPAD) using L-lactate as model analyte was developed. Introducing m-carboxy luminol as signaling molecule resulted in extraordinary signal-to-noise ratios in the final POCT setup, leading to μmolar detection limits for L-lactate and a dynamic range covering up to three orders of magnitude.
The increased hydrophilicity further allows encapsulation of this new luminophore into nanocontainer such as liposomes, to further amplify the signal intensity. In a second line of research, the previously reported m-carboxy luminol loaded liposomes were refined and investigated in standard lateral flow assay to be integrated in the current portfolio of suitable POCT labels. Initial experiments with fluorescent sulforhodamine B liposomes, revealed the power of signal amplification already for photometric detection in direct comparison to gold nanoparticles (AuNP) with an 10-fold lower LOD. Specifically, the CL approach yielded a significantly higher signal-to-noise (S/N) ratio of over 20. With fluorescence a S/N ratio of only 3.5 and surprisingly 12.8 for the colorimetric approach, was achieved which already rivals the commercial AuNP approach.
In a third line of research, CL liposomes were used as sensitive marker in an advanced neutralization assay. Here, specific interaction between the human complement system and liposomes is utilized. In a defined environment, the human complement system is able to release the dye molecules from the liposomes by directed lysis through a trigger molecule in close proximity. Within this work, initial proof-of-concept studies were conducted to first of develop liposomes with lipid compositions that are stable in human serum, so-called stealth liposomes. Subsequent to this, specific lysis through different types of trigger molecules was demonstrated. Here, antibodies or lipopolysaccharide were successfully tested for their ability to function as complement trigger. Furthermore, a bystander assay confirmed that the complement system only attacks liposomes with a trigger molecule attached to the surface. Liposomes without a trigger in close proximity to the surface remain unaffected. Finally, successful surface modification of liposomes with relevant proteins and peptides was demonstrated and the suitability of side-directed versus random coupling evaluated. Although, side-directed coupling through streptavidin and biotin offers advantages such as oriented attachment of the biomolecule to the liposomes surface, the random coupling approach yielded in a more efficient attachment of the respective
biomolecules. In summary, proof-of-concept was achieved for the individual components and the basis for the combination of the single parts to a functioning assay was generated.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Im Folgenden wurden verschiedene Strategien untersucht, um aktuelle POCT-Konzepte zu einem quantitativen diagnostischen Instrument weiterzuentwickeln. Hierfür wurden Chemilumineszenz als Detektionsmethode und Liposome als Signalverstärker untersucht. Die Chemilumineszenz (CL) bietet aufgrund ihrer Unabhängigkeit von externen Lichtquellen hervorragende analytische Performance und eignet sich ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Im Folgenden wurden verschiedene Strategien untersucht, um aktuelle POCT-Konzepte zu einem quantitativen diagnostischen Instrument weiterzuentwickeln. Hierfür wurden Chemilumineszenz als Detektionsmethode und Liposome als Signalverstärker untersucht. Die Chemilumineszenz (CL) bietet aufgrund ihrer Unabhängigkeit von externen Lichtquellen hervorragende analytische Performance und eignet sich aufgrund minimaler instrumenteller Anforderungen ideal für quantitatives POCT. Darüber hinaus ist sie aufgrund der Abwesenheit von Hintergrundsignalen außergewöhnlich empfindlich. Die anfängliche photophysikalische Charakterisierung eines neuen Luminol Derivats, m-Carboxyluminol, zeigte eine 5-fach höhere Quantenausbeute und eine verbesserte Wasserlöslichkeit gegenüber Luminol. Der Wechsel zu diesem stärker emittierenden Luminophor begünstigt bereits standardmäßige Mikrotiterplatten basierte Assays, indem deren Empfindlichkeit und Nachweisgrenze (LOD) verbessert wurden. Die Übertragung dieser Erkenntnisse auf einen papierbasierten POCT-Aufbau zeigte den Vorteil eines stärker emittierenden Luminophors im POCT-Bereich, da die Signalerfassung für allgegenwärtig verfügbare Detektionsgeräte wie einfache Smartphones zugänglich wird. Insbesondere wurde ein universelles enzymatisches mikrofluidisches papierbasiertes System (μPAD) entwickelt unter Verwendung von L-Laktat als Modell Analyt. Die Nutzung von m-Carboxyluminol als Signalmolekül führte zu außergewöhnlichen Signal-zu-Rausch-Verhältnissen im finalen POCT-Aufbau, was zu μmolaren Nachweisgrenzen für L-Lactat und einem dynamischen Bereich von über drei Größenordnungen führte.
Die erhöhte Hydrophilie ermöglicht außerdem das Einschließen dieses neuen Luminophors in Nanocontainer wie Liposome, um die Signalintensität weiter zu verstärken. In einem zweiten Forschungsschwerpunkt wurden die zuvor beschriebenen m-Carboxyluminol beladenen Liposome optimiert und in einem standardmäßigen LFA untersucht, um sie in das aktuelle Portfolio geeigneter POCT-Labels zu integrieren. Erste Experimente mit fluoreszierenden Sulforhodamin B-Liposomen zeigten die Stärke der Signalverstärkung bereits für die photometrische Detektion im direkten Vergleich zu Goldnanopartikeln (AuNP) mit einem 10-fach niedrigeren LOD. Insbesondere der CL Ansatz ergab ein deutlich höheres Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/N) von über 20. Mit Fluoreszenz wurde ein S/N-Verhältnis von nur 3,5 und überraschenderweise 12,8 für den kolorimetrischen Ansatz erreicht, welcher bereits mit dem kommerziellen AuNP-Ansatz konkurriert.
In einem dritten Forschungsschwerpunkt wurden CL Liposome als empfindliche Marker in einem weiterentwickelten Neutralisationsassay verwendet. Hierbei wird die spezifische Interaktion zwischen dem menschlichen Komplementsystem und Liposomen genutzt. In einer definierten Umgebung ist das menschliche Komplementsystem in der Lage, die eingeschlossenen Farbstoffmoleküle durch gezielte Lyse der Liposome über ein Triggermolekül, welches sich in unmittelbarer Nähe befindet, freizusetzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erste Proof-of-Concept Studien durchgeführt, um zunächst Liposome mit humanserumstabilen Lipidzusammensetzungen, sogenannte Stealth Liposome, zu entwickeln. Anschließend wurde die spezifische Lyse durch verschiedene Arten von Triggermolekülen demonstriert. Hier wurden Antikörper oder Lipopolysaccharide als kompetenter Komplementauslöser identifiziert. Darüber hinaus bestätigte ein Bystander-Assay, dass das Komplementsystem nur Liposome mit einem an der Oberfläche angebrachten Triggermolekül angreift. Liposome ohne Auslöser in unmittelbarer Nähe zur Oberfläche bleiben unbeeinflusst. Schließlich wurde die erfolgreiche Oberflächenmodifikation von Liposomen mit relevanten Proteinen und Peptiden demonstriert und die Eignung von gerichteter versus zufälliger Kopplung bewertet. Obwohl die gerichtete Kopplung durch Streptavidin und Biotin Vorteile bietet, wie z. B. eine orientierte Bindung des Biomoleküls an die Liposomeoberfläche, führte in dieser Arbeit der zufällige Kopplungsansatz zu einer effizienteren Fixierung der jeweiligen Biomoleküle. Zusammenfassend wurde für die einzelnen Komponenten des Gesamtassays ein Proof-of-Concept erreicht und die Grundlage für die Kombination der einzelnen Teile zu einem funktionierenden Assay geschaffen.
Metadaten zuletzt geändert: 01 Apr 2025 06:53
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