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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-544085
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.54408
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 29 Juni 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Guido Jürgenliemk |
| Tag der Prüfung: | 23 Juni 2023 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie (Prof. Heilmann) |
| Stichwörter / Keywords: | Madhuca longifolia, Flavan-3-ols, Epiafzelechin, antibacterial, antidiabetical |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 54408 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Bassia longifolia KOENIG ist ein ca. 20 m hoher immergrüner Baum, der in Indien, Nepal und Sri Lanka verbreitet ist. Samen, Blüten und die Rinde werden als Futter-, Lebens- und Arzneimittel genutzt. Pharmazeutisch interessant sind vor allem die Rinde und die Blüten, gegen eine Vielzahl von Indikationen. So werden die Blüten bei Husten, Erkältungen und Bronchitis angewandt. Die Rinde wird u.a. ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Bassia longifolia KOENIG ist ein ca. 20 m hoher immergrüner Baum, der in Indien, Nepal und Sri Lanka verbreitet ist. Samen, Blüten und die Rinde werden als Futter-, Lebens- und Arzneimittel genutzt. Pharmazeutisch interessant sind vor allem die Rinde und die Blüten, gegen eine Vielzahl von Indikationen. So werden die Blüten bei Husten, Erkältungen und Bronchitis angewandt. Die Rinde wird u.a. äußerlich bei Wunden angewendet und innerlich als Dekokt gegen Diabetes mellitus. Zu den traditionellen medizinischen Anwendungen sind nur wenige Studien in der Literatur zu finden. Das Inhaltsstoffspektrum ist ebenfalls kaum untersucht. So finden sich nur für die Samen seriöse Untersuchungen, die verschiedene Saponine identifizieren konnten. Für die Rinde finden sich keine Studien, in denen Inhaltsstoffe mittels spektroskopischer Methoden identifiziert werden konnten. Deshalb sollte in dieser Arbeit das Inhaltsstoffspektrum der Rinde von B. longifolia erfasst werden in Verbindung mit in vitro Untersuchungen zu den traditionellen Anwendungen zur Wundheilung und gegen Diabetes.
Zu diesem Zweck wurden durch Perkolation ein Petrolether-, ein Ethylacetat- und ein Methanol-Extrakt hergestellt. Da in einer früheren Arbeit der Ethylacetat-Extrakt gute Ergebnisse in einigen immunologischen Assays gezeigt hat, wurde begonnen, aus diesem Inhaltsstoffe zu isolieren. In dessen Aufarbeitung zeigte sich bereits ein hoher Gerbstoffanteil. Jedoch konnten aus diesem wegen zu geringen Mengen nur vier Flavan-3-ole isoliert werden. Der Gerbstoffanteil versprach in dem methanolischen Extrakt noch höher zu sein, weswegen daraufhin komplett auf den methanolischen Extrakt gewechselt wurde in der Absicht, ein umfassendes Gerbstoffprofil zu erstellen. Im Zuge des Isolierungsprozesses konnten insgesamt 16 verschiedene Flavan-3-ole isoliert werden, bestehend aus zwei Monomeren, sieben Dimeren, sechs Trimeren und einem Tetrameren. Besonders war das Vorkommen vieler Verbindungen mit Epiafzelechin-Einheiten, die nach Studium der Literatur bisher nur selten isoliert werden konnten. Die beiden Trimere Epicatechin-(4ß→8)-Epiafzelechin-(4ß→8)-Epicatechin und Epiafzelechin-(4ß→8)-Catechin-(4α→8)-Epicatechin konnten in dieser Arbeit zum ersten Mal isoliert und deren Struktur und Stereochemie zweifelsfrei nachgewiesen werden.
Zur weiteren Analyse des Gerbstoffprofils wurde eine Fraktion, angereichert mit polymeren Proanthocyanidinen, über ein 13C-NMR Verfahren untersucht. Dabei konnte ein mittlerer Polymerisationsgrad von 8-9 ermittelt werden. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass über 90% der Gerbstoffe der Polymerfraktion aus 2,3-cis-konfigurierten Einheiten besteht sowie das Vorkommen von polymeren PA mit monohydroxyliertem B-Ring, die vermutlich Epiafzelechin-Einheiten darstellen.
Nach Bestimmung des Gerbstoffgehaltes über eine modifizierte Variante der „Hautpulvermethode“ nach europäischem Arzneibuch und einer UPLC-Methode konnte ein sehr hoher Phenol- und Gerbstoffgehalt festgestellt werden. Dieser liegt wesentlich höher als der einiger Weidenarten und von Eichenrinde. Außerdem ist der Gesamtphenolgehalt so hoch wie der Gehalt an Gerbstoffen. Das lässt vermuten, dass andere phenolische Inhaltsstoffklassen nur in sehr geringen Mengen vorkommen, was auch bei der Isolierung festgestellt werden konnte. Nachdem verschiedene Verbindungen mit Epiafzelechin-Einheiten isoliert werden konnten, das Monomer jedoch nicht, sollte mittels LC-MS/MS überprüft werden, ob die Verbindung in Spuren dennoch zu finden ist. Zwei Fraktionen konnten daraufhin identifiziert werden, in denen bestimmte Ionen detektiert werden konnte, die typisch für Afzelechin sind. Dennoch scheint im Biosyntheseprozess der Flavan-3-ole in B. longifolia Epiafzelechin größtenteils direkt weiter zu den oligomeren Proanthocyanidinen weiterverarbeitet zu werden.
Der zweite große Teil der Arbeit befasste sich mit der pharmakologischen in vitro Untersuchung einzelner Fraktionen und der isolierten Substanzen. In einem Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) basierten Wundheilungsassay konnte keine beschleunigte Wundheilung beobachtet werden. Im Gegenteil konnte sogar mit einem steigenden Polymerisationsgrad der Substanzen eine verzögerte Wundheilung festgestellt werden, die vermutlich auf der Toxizität der Substanzen bei den verwendeten Epithelzellen beruht. Möglicherweise könnte die traditionelle Anwendung bei Wundheilung aber auch in antibakteriellen Effekten begründet sein, wie sie für Gerbstoffe häufig beschrieben sind. Dazu wurden zwei verschiedene Assays mit dem auf der menschlichen Haut angesiedeltem Staphylococcus aureus durchgeführt. Ein auf die Umsetzung von MTT basierter Assay konnte aufgrund der antioxidativen Eigenschaften der getesteten Flavan-3-ole nicht ausgewertet werden. Ein Assay, der auf Agarplatten durchgeführt wurde, zeigte antibakterielle Effekte für eine mit PA angereicherte Fraktion und eine Fraktion mit polymeren PA. Dabei war der Effekt umso stärker je höher der Polymerisationsgrad war. Somit könnte die Anwendung als Paste bei Wundheilung zumindest teilweise auf die antibakteriellen Eigenschaften der gerbstoffreichen Fraktionen zurückgeführt werden.
Ein α-Glucosidaseassay wurde durchgeführt, um die Anwendung gegen Diabetes mellitus zu untersuchen. Bei den getesteten Fraktionen zeigte sich ebenfalls eine stärkere Aktivität je höher der Gerbstoffanteil und der Polymerisierungsgrad waren. Des Weiteren wurden die 16 isolierten Verbindungen getestet. Alle Substanzen wiesen eine gute Hemmung der α-Glucosidase auf, wobei aber auch eine Struktur-Wirkungsbeziehung hergestellt werden konnte: es konnte beobachtet werden, dass ein steigender dP, das Vorhandensein einer 4α-Konfiguration und einer 4→6-Verknüpfung die Hemmung der α-Glucosidase begünstigen. Auch wenn der Blutzuckerspiegel durch eine Vielzahl von Mechanismen reguliert wird, kann hier mit der Hemmung der α-Glucosidase der traditionellen Anwendung eine erste Rechtfertigung gegeben werden.
Somit stellt diese Arbeit die erste umfassende Untersuchung zu den Inhaltsstoffen der Rinde von B. longifolia generell und des Gerbstoffprofils im Besonderen dar. Weiterhin konnten grundlegende pharmakologische Beiträge zur traditionellen medizinischen Anwendung zur Wundheilung und gegen Diabetes geliefert werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Bassia longifolia KOENIG is an evergreen tree, approx. 20 m tall, which is widespread in India, Nepal, and Sri Lanka. Seeds, flowers, and bark are used as fodder, food, and medicines. Of particular pharmaceutical interest are the bark and the flowers, which have a variety of indications. Flowers are used against coughs, colds, and bronchitis. The bark is used externally for wounds and internally ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Bassia longifolia KOENIG is an evergreen tree, approx. 20 m tall, which is widespread in India, Nepal, and Sri Lanka. Seeds, flowers, and bark are used as fodder, food, and medicines. Of particular pharmaceutical interest are the bark and the flowers, which have a variety of indications. Flowers are used against coughs, colds, and bronchitis. The bark is used externally for wounds and internally as a decoction against diabetes mellitus. Only a few studies on traditional medicinal uses can be found in the literature. The spectrum of ingredients has also hardly been studied. Only for the seeds there are serious studies that could identify various saponins. For the bark, there are no studies in which compounds could be identified using spectroscopic methods. Therefore, the aim of this study was to investigate the spectrum of constituents of the bark of B. longifolia in conjunction with in vitro studies on its traditional applications in wound healing and diabetes.
For this purpose, a petroleum ether extract, an ethyl acetate extract, and a methanol extract were prepared by percolation. As the ethyl acetate extract had shown good results in some immunological assays in a prior study, the isolation of compounds was started with this extract. A high content of tannins was found in this extract. However, only four flavan-3-ols could be isolated from this extract due to insufficient quantities. The tannin content promised to be higher in the methanolic extract and therefore, further studies to investigate the proanthocyanidin profil were performed with it. In the course of the isolation process, a total of 16 different flavan-3-ols could be isolated, consisting of two monomers, seven dimers, six trimers, and one tetramer. Particularly noteworthy was the occurrence of many compounds with epiafzelechin units, which, according to studies in the literature, have only rarely been found so far. The two trimers epicatechin-(4ß→8)-Epiafzelechin-(4ß→8)-Epicatechin and epiafzelechin-(4ß→8)-Catechin-(4α→8)-Epicatechin could be isolated for the first time in this work and their structure and stereochemistry could be proven definetly.
A fraction enriched with polymeric proanthocyanidins was examined via a 13C-NMR method to further analyze the tannin profile. An average degree of polymerization of 8-9 could be determined. Cis-configurated flavan-3-ol units predominate with 90% and the further occurrence of monohydroxylated flavan-3-ols was found. After determining the tannin content using a modified variant of the "skin powder method" according to the European Pharmacopoeia and an UPLC method, a very high phenol and tannin content was found which is considerably higher than that of some willow species and oak bark. In addition, the total phenol content is as high as the tannin content, which suggests that other phenolic compounds are only present in very small amounts. After various compounds with epiafzelechin units could be isolated, but not the monomer, LC-MS/MS was to be used to check whether the compound could nevertheless be found in traces. Two fractions could be identified in which certain ions typical of afzelechin could be detected.
The second major part of the work dealt with the pharmacological investigation of individual fractions and isolated substances. In an Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) based wound healing assay, no accelerated wound healing could be observed. On the contrary, delayed wound healing was observed with an increasing degree of polymerization of the substances probably due to their in vitro cytotoxicity against the used cell line. However, it is possible, that the traditional application in wound healing could be due to antibacterial effects, as they are frequently described for tanning agents. For this purpose, two different assays were carried out with Staphylococcus aureus, that naturally inhabits human skin. An MTT-based assay could not be evaluated due to the antioxidant properties of the flavan-3-ols tested. An assay performed on agar plates showed an antibacterial effect for a fraction enriched with PA and a fraction with polymeric PA. The higher the degree of polymerization, the stronger was the effect. Thus, the antibacterial properties of the tannin-rich fractions could be at least partly explain the application as a paste in wound healing.
An α-glucosidase assay was performed to investigate the use of B. longifolia in diabetes mellitus. As observed in the antibacterial assays, the fractions tested showed greater inhibition the higher the tannin content and degree of polymerization was. Furthermore, the 16 isolated compounds were tested. All substances showed good inhibition of α-glucosidase, but a structure-activity relationship could also be established. It was observed that an increasing dP, the presence of a 4α-configuration, and a 4→6 linkage lead to a stronger inhibition of α-glucosidase. Although blood glucose levels are regulated by a variety of mechanisms, the inhibition of α-glucosidase provides a first explanation for the traditional use of B. longifolia.
Thus, this work represents the first comprehensive investigation of the constituents from the bark of B. longifolia in general and of the tannin profile in particular. Furthermore, elementary pharmacological contributions to the traditional medicinal use in wound healing and diabetes could be provided.
Metadaten zuletzt geändert: 29 Jun 2023 09:04
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