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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-545706
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.54570
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 8 August 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Simone Thomas |
| Tag der Prüfung: | 27 Juli 2023 |
| Institutionen: | Medizin > Zentren des Universitätsklinikums Regensburg > Regensburger Centrum für Interventionelle Immunologie (RCI) |
| Stichwörter / Keywords: | T-Zell-Immuntherapie, akute myeloische Leukämie, allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation, induzierbare Caspase-9, Rapamycin-induzierbare Caspase-9, invariante Natürliche Killer T-Zellen |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 54570 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Im Fokus der Arbeit steht die Testung von Sicherheitsmechanismen in AML-spezifischen T-Zellen im Kontext der allogenen hämatopoetischen Blutstammzelltransplantation. Zur Verbesserung der Therapie der AML können bei der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation Donor T-Zellen eingesetzt werden, die bestimmte Zielstrukturen auf den AML-Blasten erkennen und diese anschließend eliminieren. ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Im Fokus der Arbeit steht die Testung von Sicherheitsmechanismen in AML-spezifischen T-Zellen im Kontext der allogenen hämatopoetischen Blutstammzelltransplantation. Zur Verbesserung der Therapie der AML können bei der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation Donor T-Zellen eingesetzt werden, die bestimmte Zielstrukturen auf den AML-Blasten erkennen und diese anschließend eliminieren. HLA-DP Antigene werden hauptsächlich an der Oberfläche von hämatopoetischen Zellen exprimiert und sind daher als Zielstruktur für den TZR-Transfer gut geeignet. So können Donor T-Zellen mit dem T-Zell-Rezeptor TZRDP04 ausgestattet werden, der spezifisch allogene HLA-DPB1*04:01-positive AML-Blasten des Patienten erkennt und eliminiert. Bei Entzündungsreaktionen wird die Expression von HLA-DP-Antigenen jedoch auch in nicht-hämatopoetischen Zellen hochreguliert. So könnte eine HLA-DP-gerichtete GvHD entstehen und somit auch gesunde Gewebezellen angegriffen und beschädigt werden. In diesem Fall wäre eine gezielte Abschaltung der transferierten HLA-DP-spezifischen T-Zellen wünschenswert. Ziel dieser Arbeit war es daher, verschiedene Sicherheitsmechanismen hinsichtlich ihrer Effektivität, modifizierte T-Zellen zu depletieren, zu untersuchen.
Die induzierbare Caspase-9 (iC9) ist ein Suizid-Gen-System, was zusammen mit dem spezifischen T-Zell-Rezeptor TZRDP04 in die T-Zelle transduziert werden kann. Es besteht aus dem proapoptotischen Caspase-9-Protein und einer Dimerisierungsdomäne FKBP12. Bei ersten Symptomen der GvHD könnte die induzierbare Caspase-9 durch Homodimerisierung zweier iC9-Moleküle durch den Dimerisierer AP20187 aktiviert werden und die Apoptose der T-Zelle eingeleitet werden, sodass die Schäden an nicht-hämatopoetischen Geweben abgemildert werden. Der Effekt der induzierbaren Caspase-9 konnte in vitro nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang konnten wir nachweisen, dass vor allem die iC9+TZRDP04-modifizierten T-Zellen durch Zugabe von AP20187 innerhalb von 24 Stunden in vitro absterben, nicht jedoch die nicht-modifizierten T-Zellen.
Als Alternative wurde ein Rapamycin-induzierbares Caspase-9 (RC9)-System mit den Dimerisierungsdomänen FRB und FKBP12 untersucht. Die Apoptosekaskade wird über Heterodimerisierung zweier RC9-Moleküle durch Rapamycin, ein zugelassenes Immunsuppressivum, aktiviert.
Die Experimente zum Vergleich der beiden Suizid-Gen-Systemen zeigten eine niedrigere Apoptoseeffizienz von RC9 durch Rapamycin im Vergleich zu iC9 durch AP20187. So lag die Anzahl Annexin V-positiver Zellen nach Aktivierung von RC9 durch Rapamycin immer unter dem Apoptose-Anteil nach Anschalten von iC9 durch AP20187.
Dies zeigte sich entsprechend in der Anzahl lysierter Zellen bei RC9 im Unterschied zu iC9 nach Induktion der Apoptosekaskaden durch den jeweiligen Dimerisierer.
Neben dem Einsatz verschiedener Apoptose-induzierbarer Systeme wurde untersucht, ob der TZR-Transfer in alternativen T-Zell-Subpopulationen vorteilhaft hinsichtlich einer Unterscheidung von malignen und nicht-malignen Zellen ist.
Von besonderem Interesse sind dabei invariante Natürliche Killer T (iNKT)-Zellen, da sie aufgrund ihrer kombinierten Eigenschaften von NK- und T-Zellen hämatopoetische und nicht-hämatopoetische Zellen unterscheiden können. Die Hypothese ist dadurch begründet, dass durch die Bindung von inhibitorischen Rezeptoren der iNKT-Zellen an gesunde Zellen eine Aktivierung des HLA-DP-spezifischen TZR entgegengewirkt werden könnte und somit diese Zellen nicht abgetötet würden. Hingegen könnten AML-Blasten durch fehlende inhibitorische Signale erkannt werden.
Die iNKT-Zellen von zwei verschiedenen Spendern erkennen sowohl AML-Blasten als auch gesunde Fibroblasten. In diesem Projekt ist kein Vorteil in der Modifikation von iNKT-Zellen mit spezifischen T-Zell-Rezeptoren im Vergleich zu T-Zellen beobachtet worden. Es konnte in den durchgeführten Versuchen nicht bestätigt werden, dass TZRDP04- oder TZRDP03-modifizierte iNKT-Zellen zwischen hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Zellen unterscheiden könnten.
Nachdem in diesem Projekt das Potential verschiedener Sicherheitsstrategien in der adoptiven Immuntherapie orientierend untersucht wurde, zeigt das iC9-System Vorteile gegenüber RC9. Allerdings bedarf es weitere Verbesserungen der Struktur, der Expression und der Aktivierung der Caspase-Konstrukte sowie der Expansion und Modifikation von iNKT-Zellen, um solche Methoden im Kontext einer HLA-DP-gerichteten Immuntherapie in den Klinikbereich einzuführen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
T cell immunotherapy is an efficient therapeutic strategy in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to eliminate acute myeloid leukemia (AML) blasts. HLA-DP molecules are promising target structures as HLA-DP molecules are under physiological conditions only expressed on hematopoietic cells. This project is focused on a T-cell-receptor which recognizes HLA-DPB1*04:01-positive cells ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
T cell immunotherapy is an efficient therapeutic strategy in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to eliminate acute myeloid leukemia (AML) blasts. HLA-DP molecules are promising target structures as HLA-DP molecules are under physiological conditions only expressed on hematopoietic cells. This project is focused on a T-cell-receptor which recognizes HLA-DPB1*04:01-positive cells (TCRDP04). HLA-DPB1*04:01 has the highest allele frequency and is therefore a suitable target for T-cell immunotherapies. Nevertheless, HLA-DP-expression is upregulated in inflammatory conditions. In this case also healthy cells like fibroblasts are recognized, which then potentially cause graft-versus-host disease especially of the liver, skin, and intestinal tissues. To avoid or terminate graft-versus-host disease safety strategies are needed. In this thesis two possible safety mechanisms were evaluated. First, gene-suicide-systems were used to deplete conventional T cells and second, invariant natural killer T (iNKT) cells were investigated in terms of safety after TCRDP transfer.
One possible safety strategy in T cell immunotherapy is the transduction of T cells with the specific T-cell receptor (TCRDP04) together with a gene-suicide-system like inducible caspase-9 (iC9) or Rapamycin-inducible caspase-9 (RC9). The inducible caspase-9 contains the catalytic domain of the caspase-9 and the mutated dimerizing domain FKBP12. After applying the dimerizer AP20187 two iC9-molecules are linked together which activates caspase-9 and induces the apoptosis cascade. In this work, the function of the iC9 co-expressed with the TCRDP04 was tested in several experiments with four different T cell donors. iC9 activity was proven by flow cytometry with Annexin V and in a cytotoxicity assay. After incubation with AP20187 for 24 and 48 hours an apoptosis rate of up to 60 % was measured in TCRDP04- and iC9-expressing T cells.
As Rapamycin in contrast to AP20187 is already clinically approved, the use of Rapamycin-inducible Caspase-9 (RC9) was also analyzed. Compared with the iC9 approach expression of RC9 resulted in lower apoptosis rates. It seemed that the activation of Rapamycin-inducible caspase-9 with the two different dimerizing domains FRB and FKBP12 by Rapamycin is more complex and therefore less efficient.
iNKT cells are a cell population sharing features of NK and T cells and connect innate and adaptive immune response. In this context, iNKT cells modified with HLA-DP specific TCR were investigated, focusing on their ability to descriminate between hematopoetic and non-hematopoetic cells.
Theoretically, this could lead to a more specific Graft-versus-leukemia (GvL) reaction. For this, activity of TCR modified iNKT cells was assayed against AML blast and IFN-γ pretreated fibroblasts.
The two different iNKT cells donors showed activation after recognition of both AML blasts and fibroblasts in an IFN-γ-ELISpot Assay. Unfortunately, iNKT cells modified with TCRDP also showed recognition of IFN-γ-treated fibroblasts and therefore could mediate Graft-versus-host disease (GvHD).
In summary, safety strategies in allogeneic stem cell transplantation are extremely important and aim to reduce or avoid Graft-versus-host disease. Gen-suicide-systems show a great potential to avoid Graft-versus-host disease, especially in combination with specific TCRs like TCRDP04 mediating a Graft-versus-leukemia effect. In contrast, there would presumably be no advantage in using TCR modified iNKT cells instead of T cells. Although the projects revealed some first insights to safer immunotherapy, further in vitro and in vivo studies have to follow before these approaches can be used in clinical applications.
Metadaten zuletzt geändert: 08 Aug 2023 08:13
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