![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/application_pdf.png) | License: Publishing license for publications excluding print on demand PDF - Accepted Version (10MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-545725
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.54572
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 1 August 2025 |
| Referee: | Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Date of exam: | 19 July 2023 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Keywords: | RNA Polymerase I, Saccharomyces cerevisiae, A12.2, A49, A34.5, Transkription, in vitro Analysen |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 54572 |
Abstract (English)
DNA-dependent RNA polymerases (Pols) transcribe the genome of all organisms to RNA (transcriptom). Three nuclear Pols are common to all eukaryotic cells, namely Pol I, Pol II and Pol III. These highly specific multi-subunit enzymes transcribe different sets of genes and differ in subunit composition, associated regulatory elements, and accessory factors. In Saccharomyces cerevisiae, Pol I is ...
Abstract (English)
DNA-dependent RNA polymerases (Pols) transcribe the genome of all organisms to RNA (transcriptom). Three nuclear Pols are common to all eukaryotic cells, namely Pol I, Pol II and Pol III. These highly specific multi-subunit enzymes transcribe different sets of genes and differ in subunit composition, associated regulatory elements, and accessory factors. In Saccharomyces cerevisiae, Pol I is composed of 14 subunits and transcribes exclusively ribosomal DNA. Despite its evolutionary conserved ten-subunit catalytic core shared with Pol II and Pol III, Pol I additionally contains the Pol-specific subunits A12.2, A34.5 and A49. These subunits are stably associated with its lobe domain and considered as built-in transcription factors due to functional and structural similarities with transcription factors of Pol II. While Pol II and its transcription factors have been intensively studied, less is known about Pol I and the role of its Pol I-specific subunits for different steps of the transcription cycle. Here, we used a new established Pol I in vitro reconstitution system and in vitro transcription assays with specific templates to investigate the function of different subdomains of A12.2, A34.5 and A49 on transcription initiation and transcription elongation to gain detailed insights for the mechanistic roles these subunits especially in Pol I transcription fidelity and processivity. Transcription fidelity relies either on correct nucleotide selection or on proofreading. While nucleotide selectivity seems to be less influenced by A12.2, A34.5 and A49, proofreading is strongly affected by these subunits. Proofreading entails RNA cleavage and backtracking after misincorporation of nucleotides, as well as re-extension of cleaved RNA. For sufficient RNA cleavage, Pol I requires the subunit A12.2, but not A34.5 and A49. More particularly, only full-length A12.2 containing the conserved amino acids D105 and E106 efficiently mediates RNA cleavage. By contrast, the C-terminal domain of A12.2 alone mediates insufficient RNA cleavage. We conclude that the covalent linkage between the C- and N-terminal domains of A12.2 as well as the amino acids D105/E106 are required for the high intrinsic cleavage activity of Pol I. Similar to the function of A12.2, TFIIS stimulates the intrinsic cleavage activity of Pol II thereby promoting proofreading. Domains of A12.2 and TFIIS are only partly exchangeable which gives mechanistic insights in the elongation/cleavage mode of Pol I and Pol II. Further, RNA cleavage activity as well as backtracking of Pol I is strongly stimulated by A34.5 together with A49 or the N-terminal and linker domains of A49 (A49NTL). Re-extension of cleaved RNAs is only promoted by full-length A49 in combination with A34.5. Experiments with different domains of the lobe binding subunits revealed that the cleavage activity in combination with either the heterodimer or A49LCT is required for processivity of Pol I. Summarizing, the interplay of the Pol I-specific subunits positively influence transcription elongation. It seems that domains of the Pol I-specific subunits have either a positive effect on transcription fidelity (A12.2 and A49NTL/A34.5) or on transcription processivity (A49LCT). Furthermore, I could show that the interplay between the Pol I-specific subunits A12.2, A34.5 or A49 Is not only important for efficient transcription elongation, but also for efficient transcription initiation. These results suggest that the interplay between the Pol I-specific subunits A12.2, A49 and A34.5 is not only important for efficient transcription elongation, but also for efficient transcription initiation.
Consequently, our results significantly contribute to the identification of functional similarities and differences between subdomains of Pol I-specific subunits and subdomains of corresponding transcription factors of Pol II for unravelling features unique to the Pol I machinery. For ongoing and future research, our experimental setup will help to fill the gap in knowledge about the Pol I machinery and its “built-in” factors and about their role in transcription termination including transcription through nucleosomes.
Translation of the abstract (German)
DNS-abhängige RNS Polymerasen (Pols) transkribieren das Genom aller Organismen in RNS (Transkriptom). Alle eukaryotischen Zellen besitzen drei Pols, die im Zellkern lokalisiert sind und Pol I, Pol II and Pol III genannt werden. Diese sehr spezifischen Proteinkomplexe transkribieren verschiedene Gene und unterscheiden sich im Aufbau, assoziierten, regulatorischen Elementen und zusätzlichen ...
Translation of the abstract (German)
DNS-abhängige RNS Polymerasen (Pols) transkribieren das Genom aller Organismen in RNS (Transkriptom). Alle eukaryotischen Zellen besitzen drei Pols, die im Zellkern lokalisiert sind und Pol I, Pol II and Pol III genannt werden. Diese sehr spezifischen Proteinkomplexe transkribieren verschiedene Gene und unterscheiden sich im Aufbau, assoziierten, regulatorischen Elementen und zusätzlichen Faktoren. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist Pol I aus 14 Untereinheiten aufgebaut und transkribiert ausschließlich ribosomale RNS. Neben dem evolutionär konservierten katalytischen Kern, der aus zehn Untereinheiten aufgebaut ist und ebenso in Pol II und III vorhanden ist, besitzt Pol I zusätzlich die Pol I-spezifische Untereinheiten A12.2, A34.5 und A49. Diese Untereinheiten assoziieren mit der „lobe“ Domaine von Pol I und werden „built-in“-Faktoren genannt, da sie funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten mit Transkriptionsfaktoren von Pol II aufweisen. Wohingegen Pol II und seine Transkriptionsfaktoren sehr gut untersucht wurden, ist bislang wenig über Pol I und seine spezifischen Untereinheiten bekannt. In dieser Arbeit wurde mittels eines neu etablierten in vitro Rekonstitutionssystems und in vitro Transkriptionsassays mit spezifischen DNA-Matrizen die Funktion der unterschiedlichen Domänen von A12.2, A34.5 und A49 auf die Initiation und Elongation (im Besonderen wird eingegangen auf die Genauigkeit und Prozessivität) untersucht, um detaillierteres Wissen über deren mechanistische Rolle bezüglich der Pol I Transkriptionsmaschinerie zu erlangen. Genauigkeit während der Transkription beruht entweder auf richtiger Nukleotidauswahl oder auf Korrekturmechanismen. Während die Nukleotidselektivität kaum von A12.2, A49 und A34.5 beeinflusst zu sein scheint, sind Korrekturmechanismen stark von diesen Untereinheiten beeinflusst. Korrekturmechanismen enthalten die Abspaltung von Nukleotiden und Backtracking nach dem Fehleinbau von Nukleotiden genauso wie die Verlängerung von durch hydrolytische Spaltung verkürzten RNSs. Für effiziente RNS Spaltung benötigt Pol I nur die Untereinheit A12.2, nicht aber die Untereinheiten A49 und A34.5. Genauer gesagt ist nur die gesamte Untereinheit A12.2 mit den konservierten Aminosäuren D105 und E106 kompetent, Nukleotide effizient abzuspalten. Im Gegensatz dazu ist die C-terminale Domäne von A12.2 (A12.2CT) nicht ausreichend. Es wird vermutet, dass eine kovalente Bindung zwischen den N- und C-terminalen Domänen von A12.2 sowie die konservierten Aminosäuren D105 und E106 für die Spaltungsaktivität von Pol I notwendig sind. Ähnlich zur Funktion von A12.2 kann auch TFIIS die intrinsische Spaltungsaktivität von Pol II stimulieren, wodurch die Korrekturmechanismen von Pol II verbessert werden. Da Domänen von A12.2 und TFIIS nur teilweise gegeneinander austauschbar sind, konnten mechanistische Einblicke erlangt werden, die dazu beitragen, den Elongations- und Spaltungsmodus von Pol I und Pol II zu analysieren. Des Weiteren werden die Spaltungsaktivität und das Backtracking von Pol I stark durch die Untereinheiten A34.5 und die N-terminale Domäne von A49 zusammen mit dessen Linkerregion (A49NTL) oder der gesamten Untereinheit A49 stimuliert. Die Verlängerung von gespaltenen RNSs ist nur in Anwesenheit von A49 und A34.5 effizient. Experimente mit verschiedenen Domänen der Untereinheiten A12.2, A49 und A34.5 zeigten auf, dass die RNS Spaltungsaktivität in Kombination mit entweder A49/A34.5 oder A49LCT für die Prozessivität von Pol I benötigt wird. Zusammenfassend hat die Interaktion der Pol I spezifischen Untereinheiten einen positiven Einfluss auf die Elongation. Interessanter Weise scheint es, dass die Pol I spezifischen Untereinheiten entweder einen positiven Effekt auf die Genauigkeit von Pol I (12.2 and A49NTL/A34.5) oder die Prozessivität (A49LCT) haben. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass das Zusammenspiel der Untereinheiten A12.2, A34.5 und A49 nicht nur für eine effiziente Elongation, sondern auch für eine effiziente Initiation wichtig sind.
Daher haben wir einige Indizien für die Hypothese, dass die Untereinheiten A12.2, A49 und A34.5 möglicher Weise nicht nur als Untereinheiten von Pol I agieren, sondern auch die Funktion von Transkriptionsfaktoren ausüben können. Folglich tragen unsere Ergebnisse maßgeblich zur Identifizierung funktioneller und struktureller Unterschiede zwischen Subdomänen der Pol I-spezifischen Untereinheiten und Subdomänen der korrespondierenden Transkriptionsfaktoren von Pol II bei, um Pol I spezifische Eigenschaften aufzudecken. Für weitere und künftige Untersuchungen wird unser experimentelles Setup helfen, Wissenslücken bezüglich der Pol I Transkriptionsmaschinerie und der Pol I-spezifischen Untereinheiten zu füllen, auch in Bezug auf deren Rolle in Termination oder Transkription durch Nukleosomen.
Metadata last modified: 01 Aug 2025 04:26
Owner only: item control page
Download Statistics