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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-550088
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.55008
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 17 November 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Gunhild Sommer |
| Tag der Prüfung: | 14 November 2023 |
| Institutionen: | Medizin > Abteilung für Pädiatrische Hämatologie, Onkologie und Stammzelltransplantation |
| Stichwörter / Keywords: | sncRNA7SL, La protein, Alu elements, RISC, Argonaute, 7SL RNA, Molecular Beacon |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Nein |
| Dokumenten-ID: | 55008 |
Zusammenfassung (Deutsch)
The RNA-binding protein La plays a major role in the processing and maturation process of RNA polymerase III (Pol III) precursor transcripts, such as tRNA and the long non-coding RNA 7SL. Depletion of the La protein in cancer cells causes aberrant expression of small non-coding (snc) RNAs derived from RNA Pol III transcripts, as recently demonstrated for tRNA-derived miRNAs. Herein a sncRNA was ...
Zusammenfassung (Deutsch)
The RNA-binding protein La plays a major role in the processing and maturation process of RNA polymerase III (Pol III) precursor transcripts, such as tRNA and the long non-coding RNA 7SL. Depletion of the La protein in cancer cells causes aberrant expression of small non-coding (snc) RNAs derived from RNA Pol III transcripts, as recently demonstrated for tRNA-derived miRNAs.
Herein a sncRNA was identified, referred to as sncRNA7SL, which is more than twofold upregulated in La-depleted cancer cells. The sncRNA7SL sequence is identical to the 3’-end of the 7SL RNA transcript, the ancestor of all Alu elements.
In the first objective, sncRNA7SL was shown to have tumor-suppressive properties in neuroblastoma, since sncRNA7SL overexpression showed a decrease in proliferation, viability, mobility, spheroid growth, and BMI1 protein expression in neuroblastoma cells, while also resulting in a G1 arrest. Moreover, inhibition of sncRNA7SL increased viability in neuroblastoma and Ewing sarcoma cell lines.
In a second objective, the application of Molecular beacons revealed that endogenous sncRNA7SL mainly localized in the nucleus with a slight signal in the cytoplasm, while endogenous 7SL RNA was mainly localized in the cytoplasm.
The third objective aimed to optimize synthetic fluorescence-labeled sncRNA7SL oligoribonucleotides as toop applicable for localization and binding studies. It was revealed that 5’- and 3’-ends are of critical importance the correct localization of sncRNA7SL, showing that oligonucleotides labeled at the 3’- or 5’-end accumulated in the nucleus as nuclear bodies, while internally labeled sncRNA7SL showed a diffuse signal in the nucleus and therefore resembled the endogenous localization of sncRNA7SL. In addition, internally labeled sncRNA7SL accumulated also to some extent in small cytoplasmic bodies. RNA FISH and immunofluorescence studies revealed that some of those nuclear bodies are paraspeckles. Interestingly paraspeckles are known to store mRNAs containing inverted repeat Alu elements. Since the sncRNA7SL sequence was found in the Alu element of the 7SL precursor those sequences are potential targets for sncRNA7SL. To analyze colocalization between FAM-sncRNA7SL and KNL1 mRNA, containing IRAlu elements in its 3’UTR, was investigated. Partial colocalization of FAM-sncRNA7SL and KNL1 mRNA was confirmed. Furthermore, partial colocalization between sncRNA7SL-inte-FAM and EDC4 protein was found. sncRNA7SL binding of cytoplasmic Argonauts (see below) and colocalization with EDC4 protein indicates the formation of an RNA silencing complex and a potential role of sncRNA7SL in post-transcriptional gene silencing. These studies demonstrate that internally fluorescent labeled sncRNA are powerful tools to study cellular localization as well as colocalization with other RNAs and proteins.
As a last objective, the binding of Argonauts, which are known binding partners of small non-coding RNAs, to sncRNA7SL was investigated. Binding assays between HA-tagged Argonauts (Ago2-HA, Ago3-HA, PIWIL4-HA) and sncRNA7SL-inte-FAM revealed strong in vitro binding between Ago3-HA or PIWIL4-HA and sncRNA7SL-inte-FAM. Strikingly, this binding was not observed when the sncRNA7SL was end-labeled, underscoring the importance of free 5’- and 3’-ends and demonstrating that synthetics and internally labeled sncRNA7SL can be used in live cell imaging as well as in binding studies.
Taken together, the results suggests that the tumor suppressive function of sncRNA7SL is mediated in part via posttranscriptional gene silencing in the cytoplasm and, based on the colocalization with target mRNA in paraspeckle, a yet enigmatic nuclear mechanism. The development of sncRNA7SL-inte-FAM will prove to be key for further studies on the role and function of sncRNA7SL.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das RNA-bindende Protein La spielt eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung und Reifung von Vorläufertranskripten der RNA-Polymerase III (Pol III), wie z. B. tRNA und die lange nicht-kodierende RNA 7SL. Die Deletion des La-Proteins in Krebszellen führt zu einer abweichenden Expression von kleinen nicht-kodierenden (snc) RNAs, die von RNA Pol III-Transkripten abgeleitet sind, wie kürzlich für ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das RNA-bindende Protein La spielt eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung und Reifung von Vorläufertranskripten der RNA-Polymerase III (Pol III), wie z. B. tRNA und die lange nicht-kodierende RNA 7SL. Die Deletion des La-Proteins in Krebszellen führt zu einer abweichenden Expression von kleinen nicht-kodierenden (snc) RNAs, die von RNA Pol III-Transkripten abgeleitet sind, wie kürzlich für tRNA-abgeleitete miRNAs nachgewiesen wurde.
In diesem Projekt wurde eine sncRNA identifiziert, die als sncRNA7SL bezeichnet wird und in La-depletierten Krebszellen um mehr als das Doppelte erhöht ist. Die Sequenz der sncRNA7SL ist identisch mit dem 3'-Ende des 7SL-RNA-Transkripts, dem Vorläufer aller Alu-Elemente.
Im Rahmen des ersten Ziels wurde gezeigt, dass die sncRNA7SL tumorsuppressive Eigenschaften in Neuroblastomzellen aufzeigt, da die Überexpression der sncRNA7SL zu einem Rückgang der Proliferation, der Vitalität, der Mobilität, des Sphäroidwachstums und der Expression von Protein BMI1 in Neuroblastomzellen führte und gleichzeitig einen G1-Arrest bewirkte. Darüber hinaus erhöhte die Hemmung von sncRNA7SL die Lebensfähigkeit in Neuroblastom- und Ewing-Sarkom-Zelllinien.
In einem zweiten Ziel zeigte die Anwendung von Molecular Beacons, dass die endogene sncRNA7SL hauptsächlich im Zellkern lokalisiert war, mit einem geringen Signal im Zytoplasma, während die endogene 7SL-RNA hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert war.
Das dritte Ziel bestand in der Optimierung synthetischer fluoreszenzmarkierter sncRNA7SL-Oligoribonukleotide, die sich für Lokalisierungs- und Bindungsstudien eignen. Es zeigte sich, dass die 5'- und 3'-Enden für die korrekte Lokalisierung von sncRNA7SL von entscheidender Bedeutung sind. Außerdem wurde gezeigt, dass Oligonukleotide, die am 3'- oder 5'-Ende markiert waren, sich im Zellkern als Kernkörperchen anreicherten, während intern markierte sncRNA7SL ein diffuses Signal im Zellkern zeigte und somit der endogenen Lokalisierung von sncRNA7SL ähnelte. Darüber hinaus akkumulierte intern markierte sncRNA7SL in gewissem Umfang auch in kleinen zytoplasmatischen Körpern. RNA-FISH- und Immunfluoreszenzstudien ergaben, dass es sich bei einigen dieser Kernkörperchen um Paraspeckle handelt. Interessanterweise sind Paraspeckle dafür bekannt, mRNAs zu speichern, die invertierte Repeat-Alu-Elemente enthalten. Da die sncRNA7SL-Sequenz im Alu-Element des 7SL-Vorläufers gefunden wurde, sind diese Sequenzen potenzielle Ziele für sncRNA7SL. Um die Kolokalisation zwischen der FAM-sncRNA7SL und der KNL1 mRNA, die IRAlu-Elemente in ihrer 3'UTR enthält, zu analysieren, wurde diese untersucht. Eine partielle Kolokalisation von FAM-sncRNA7SL und KNL1 mRNA wurde bestätigt. Darüber hinaus wurde eine teilweise Kolokalisation zwischen sncRNA7SL-inte-FAM und EDC4-Protein festgestellt. Die Bindung der sncRNA7SL an zytoplasmatische Argonauten (siehe unten) und die Kolokalisation mit dem EDC4-Protein deuten auf die Bildung eines RNA-Silencing-Komplexes und eine mögliche Rolle der sncRNA7SL beim posttranskriptionalen Gen-Silencing hin. Diese Studien zeigen, dass intern fluoreszierend markierte sncRNA ein leistungsfähiges Instrument zur Untersuchung der zellulären Lokalisierung sowie der Kolokalisation mit anderen RNAs und Proteinen sind.
Als letztes Ziel wurde die Bindung von Argonauten, die bekannte Bindungspartner von kleinen nicht-kodierenden RNAs sind, an sncRNA7SL untersucht. Bindungstests zwischen HA-markierten Argonauten (Ago2-HA, Ago3-HA, PIWIL4-HA) und sncRNA7SL-inte-FAM zeigten eine starke in vitro Bindung zwischen Ago3-HA oder PIWIL4-HA und sncRNA7SL-inte-FAM. Auffallend ist, dass diese Bindung nicht beobachtet wurde, wenn die sncRNA7SL endmarkiert war, was die Bedeutung der freien 5'- und 3'-Enden unterstreicht und zeigt, dass synthetische und intern markierte sncRNA7SL sowohl in Lebendzell-Imaging als auch in Bindungsstudien verwendet werden können.
Zusammengenommen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die tumorsuppressive Funktion der sncRNA7SL zum Teil über posttranskriptionelles Gen-Silencing im Zytoplasma und, basierend auf der Kolokalisierung mit der Ziel-mRNA im Paraspeckle, über einen noch rätselhaften nukleären Mechanismus vermittelt wird. Die Entwicklung von sncRNA7SL-inte-FAM wird sich als Schlüssel für weitere Studien über die Rolle und Funktion der sncRNA7SL erweisen.
Metadaten zuletzt geändert: 17 Nov 2023 05:58
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