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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-553315
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.55331
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 7 Januar 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Markus Kretz |
| Tag der Prüfung: | 19 Dezember 2023 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I |
| Stichwörter / Keywords: | lncRNA, human skin, epidermal homeostasis, keratinocytes, epidermal proliferation, epidermal differentiation, organotypic tissue |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 55331 |
Zusammenfassung (Englisch)
The human epidermis is an essential part of the organism that prevents excessive loss of body water and provides protection of vulnerable tissues against environmental hazards such as pathogens, irradiation, chemicals or mechanical trauma. This is achieved by establishment of an impermeable, sturdy barrier of tightly linked cells in its uppermost layers. In order for these functions too be ...
Zusammenfassung (Englisch)
The human epidermis is an essential part of the organism that prevents excessive loss of body water and provides protection of vulnerable tissues against environmental hazards such as pathogens, irradiation, chemicals or mechanical trauma. This is achieved by establishment of an impermeable, sturdy barrier of tightly linked cells in its uppermost layers. In order for these functions too be steadily carried out in a correct fashion, the epidermis undergoes a process of constant renewal which is referred to as epidermal homeostasis. During this, proliferatively active basal keratinocytes give rise to daughter cells that are committed to step into a fixed differentiation program on their way to the body surface which results in barrier formation in the final stages before they are ultimately shed off from the skin. Unsurprisingly, this complex process needs to be tightly controlled since even the occurrence of seemingly small disturbances in homeostasis may manifest in severe skin diseases. Hence, the role of multiple known signaling pathways in epidermal homeostasis has been well characterized. Yet, the probable prevalence of additional regulatory layers suggests the presence of more biomacromolecules such as proteins or non-coding RNAs that are involved in the upholding of epidermal functions.
In a screening for potential regulatory long non-coding transcripts in epidermal homeostasis, a novel RNA that we termed P4 had been shown to be upregulated in proliferating compared to differentiated keratinocytes. In subsequent experiments, we had roughly investigated the transcript in terms of exonic architecture, polyadenylation status, localization and abundance. Moreover, initial phenotypical analyses upon P4 depletion had shown striking changes related to keratinocyte differentiation. Due to the fact that P4 was still widely uncharacterized apart from reported functions in cancer tissue, we attempted to shed further light on this RNA in human keratinocytes regarding basic transcript features, associated phenotypical alterations and possible interactors.
Our analyses showed shared differentiation-dependent P4 expression patterns across multiple keratinocyte cell lines as well as elevated transcript levels in several types of cancer cells. At least one more P4 isoform in addition to the originally identified full-length transcript was found to be present in keratinocytes. Furthermore, our experiments resulted in low probabilities of an open reading frame within the P4 sequence to be translated into a functional protein, whereas association of the RNA with ribosomes was demonstrated. A secondary structure that was computed under consideration of experimental data exhibited modular organization into two independent domains.
While overexpression of the transcript did not result in any obvious changes, P4 knockdown in organotypic tissue culminated in a plethora of associated phenotypical alterations. These included the occurrence of uncommon histological features, enhanced DNA replication, altered distribution of cytoskeletal proteins and variations in the lipidomic profile. Additionally, P4 depletion in 2D-cultured primary keratinocytes revealed multiple related effects such as shift of cells towards the synthetic phase of cell cycle, reduced keratinocyte adhesion and migration as well as conditionally increased cell growth.
Three distinct screening approaches were employed to identify putative protein interactors of P4, of which some were validated in subsequent experiments. Hence, P4 was shown to bind to phenylalanyl-tRNA-ligase subunit β (FARSB), the centrosome-associated centrin-2 (CETN2) and double-stranded RNA-binding protein Staufen homolog 2 (STAU2).
The detailed nature of P4 binding to these proteins and downstream mechanisms that explain the observed phenotypes remain to be elucidated by subsequent experiments. Nevertheless, in the course of the here presented studies P4, a novel key element in human epidermal homeostasis, was extensively characterized in keratinocytes with regard to the transcript per se, related phenotypical manifestations and its protein interactome.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die menschliche Epidermis ist ein essenzieller Bestandteil des Körpers, der sowohl überschüssigen Wasserverlust verhindert als auch darunterliegende verwundbare Gewebe vor äußeren Gefahren wie Pathogenen, Strahlung, Chemikalien oder mechanischen Traumata beschützt. Bewerkstelligt wird dies durch die Bildung einer undurchlässigen, widerstandsfähigen Barriere aus eng miteinander verbundenen Zellen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die menschliche Epidermis ist ein essenzieller Bestandteil des Körpers, der sowohl überschüssigen Wasserverlust verhindert als auch darunterliegende verwundbare Gewebe vor äußeren Gefahren wie Pathogenen, Strahlung, Chemikalien oder mechanischen Traumata beschützt. Bewerkstelligt wird dies durch die Bildung einer undurchlässigen, widerstandsfähigen Barriere aus eng miteinander verbundenen Zellen in den obersten Schichten. Damit ihre Funktionen durchgehend in korrekter Art und Weise ausgeführt werden, durchläuft die Epidermis einen Prozess der konstanten Erneuerung, auch epidermale Homöostase genannt. Währenddessen bilden proliferativ aktive basale Keratinozyten neue Tochterzellen, welche auf ihrem Weg zur Körperoberfläche in ein spezifisches Differenzierungsprogramm eintreten und in den letzten Schritten eine Barriere bilden, bevor sie letztendlich von der Haut abgeschuppt werden. Erwartungsgemäß bedarf dieser komplexe Prozess strenger Kontrolle, zumal sich selbst das Auftreten kleiner homöostatischer Unregelmäßigkeiten in ausgeprägten Hautkrankheiten widerspiegeln kann. Dementsprechend ist die Rolle vieler Signalwege in epidermaler Homöostase gut charakterisiert. Nichtdestotrotz lässt die wahrscheinliche Existenz zusätzlicher regulatorischer Ebenen auf das Vorkommen weiterer biologischen Makromoleküle wie etwa Proteine oder nichtkodierender RNAs schließen, die in der Aufrechterhaltung epidermaler Funktionen involviert sind.
In einem Screening-Verfahren zur Identifizierung potenziell regulatorischer, nichtkodierender Transkripte hatte eine neuartige RNA, die wir daraufhin P4 nannten, höhere Expressionslevel in proliferierenden verglichen mit differenzierten Keratinozyten gezeigt. In Folgeexperimenten hatten wir das Transkript bereits grob in Bezug auf Exonarchitektur, Polyadenylierungsstatus, Lokalisierung und Abundanz untersucht. Zudem hatten erste phänotypische Analysen nach P4-Knockdown markante Veränderungen in Hinblick auf die Differenzierung von Keratinozyten aufgezeigt. Da P4 abseits einiger bekannten Funktionen in Krebsgewebe noch weitgehend unerforscht war, strebten wir danach, jene RNA weiter bezüglich ihrer grundlegenden Transkripteigenschaften, assoziierten phänotypischen Veränderungen und möglichen Interaktionspartnern zu ergründen.
Unsere Analysen zeigten, dass P4 in über Keratinozytenzelllinien hinweg ein ähnliches, vom Differenzierungsstatus abhängiges Expressionsmuster aufzeigt, zudem wurden in einigen Arten von Krebszellen erhöhte Transkriptmengen detektiert. Zusätzlich zum ursprünglich identifizierten langen Transkript wurde mindestens eine weitere P4-Isoform in Keratinozyten nachgewiesen. Ein innerhalb der P4-Sequenz von befindlicher offener Leserahmen weist laut unserer Experimente nur eine geringe Wahrscheinlichkeit der Translation in ein funktionales Protein auf, jedoch wurde eine Assoziation des Transkripts mit Ribosomen gezeigt. Eine wahrscheinliche Sekundärstruktur von P4, die unter Einbezug experimenteller Daten berechnet wurde, zeigt eine modulare Organisation zweier unabhängiger Domänen.
Während die Überexpression von P4 keine eindeutigen Unregelmäßigkeiten hervorbrachte, mündete Herunterregulierung der RNA in organotypischem Gewebe in einer Vielzahl damit verbundener phänotypischer Änderungen. Diese umfassten das Auftreten ungewöhnlicher histologischer Besonderheiten, angehobene DNA-Replikation, veränderte Verteilung struktureller Proteine und Abweichungen in der Lipidkomposition. Des Weiteren enthüllte Depletion von P4 in 2D-kultivierten primären Keratinozyten mehrere damit einhergehende Effekte, darunter eine Verschiebung der Zellpopulationen hin zur Synthesephase des Zellzyklus, verminderte Zelladhäsion und Migration sowie erhöhtes Zellwachstum unter bestimmten Bedingungen.
Drei unterschiedliche Methoden wurden zur Identifikation von Proteinkandidaten mit potenzieller P4-Interaktion herangezogen, manche der resultierenden Proteine wurden wiederum in Folgeexperimenten validiert. Auf diesem Wege konnte eine Bindung von P4 an die β-Untereinheit der Phenylalanyl-tRNA-Synthetase (FARSB), an das zentrosomenassoziierte Centrin-2 (CETN2) und an das Doppelstrang-RNA-Bindeprotein Staufen Homolog 2 (STAU2) gezeigt werden.
Der genaue Ablauf dieser Interaktionen sowie nachfolgende mechanistische Schritte, welche die beobachteten Phänotypen erklären, verbleiben Gegenstand künftiger Untersuchungen. Nichtsdestotrotz konnte P4, ein neuartiges Schlüsselelement humaner epidermaler Homöostase, im Laufe der hier präsentierten Studien umfassend in Hinblick auf das Transkript an sich, verwandte phänotypische Manifestationen und interagierende Proteine charakterisiert werden.
Metadaten zuletzt geändert: 07 Jan 2025 06:13
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