Proteinphosphatase-1-Inhibitor-1 (I-1) ist ein Protein, welches die elektromechanische Kopplung moduliert: Es wird von der PKA an Stelle Thr-35 mittels Phosphorylierung aktiviert und hemmt dann deren Gegenspieler, die PP-1. Somit bewirkt es eine positive Rückkopplung und Verstärkung des PKA-Signalweges.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die CaMKII über weitere, bisher nicht untersuchte ...
Abstract (German)
Proteinphosphatase-1-Inhibitor-1 (I-1) ist ein Protein, welches die elektromechanische Kopplung moduliert: Es wird von der PKA an Stelle Thr-35 mittels Phosphorylierung aktiviert und hemmt dann deren Gegenspieler, die PP-1. Somit bewirkt es eine positive Rückkopplung und Verstärkung des PKA-Signalweges.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die CaMKII über weitere, bisher nicht untersuchte Phosphorylierungsstellen von I-1 einen funktionellen Einfluss auf dessen Funktion hat.
Hierzu wurde in Zellkulturen aus I-1-Knockout Mäusen mittels adenoviraler Expression die Wildtyp-Variante von I-1, sowie verschiedene phosphomimetisch aktive Mutanten von I-1 (T42D, S46D, S47D, T136D) exprimiert und anschließend Zielproteine des PKA- und CaMKII-Signalweges mittels Western-Blotting untersucht. Hierbei zeigte lediglich in der I-1 S46D Mutante PLB an Stelle Ser-16 eine in kleinem, aber signifikantem (p = 0,038) Umfang vermehrte Phosphorylierung. Da jedoch die ebenfalls durch die PP-1 regulierte unmittelbar benachbarte Thr-17 Stelle keine signifikante Veränderung zeigte (minimaler Trend zu minimal höherem Phosphorylierungsniveau) ist unklar, ob es sich hierbei angesichts der Vielzahl der untersuchten Mutanten und Zielproteine nicht nur um eine statistische Schwankung ohne tatsächlichen Effekt handelt. Hinweise auf einen starken, globalen Einfluss auf die untersuchten Zielproteine zeigten sich nicht. Auch ergab sich kein Hinweis auf eine relevante Veränderung der CaMKII-Aktivität (gemessen durch die CaMKII Thr-286 Autophosphorylierung und mit der PLB Thr-17 Phosphorylierung als Surrogatparameter) durch die untersuchten I-1-Mutanten.
Mittels Phosphatase-Assay und der PP-1 spezifischen Inhibitoren Okadasäure und Tautomycin wurde untersucht, ob eine massive, transgene Überexpression der CaMKII einen Einfluss auf die Aktivität der PP-1 hat. Hierbei zeigte sich kein signifikanter Einfluss der CaMKII-Überexpression auf die PP-1 Aktivität. Somit scheint die CaMKII die Aktivität der PP-1 nicht global in wesentlichem Maße zu beeinflussen.
Möglicherweise ist jedoch auf subzellulärer Ebene eine kompartimentelle Regulation vorhanden, welche sich im „globalen“ Western-Blot nicht nachweisen lässt. Somit wäre für die weitergehende Untersuchung, insbesondere der I-1 Ser-46 Phosphorylierung eine Auftrennung der Zellfraktionen z.B. mittels Zentrifugation interessant.
Translation of the abstract (English)
Proteinphosphatase-1 inhibitor-1 (I-1) is a protein which modifies the cardiac excitation-contraction coupling: I-1 is activated by PKA via phosphorylation of Thr-35 and thereby inhibits the PKA antagonistic PP-1, thus causing positive feedback and augmentation of the PKA signaling pathway.
This thesis investigated whether CaMKII has a functional influence on the function of I-1 through not yet ...
Translation of the abstract (English)
Proteinphosphatase-1 inhibitor-1 (I-1) is a protein which modifies the cardiac excitation-contraction coupling: I-1 is activated by PKA via phosphorylation of Thr-35 and thereby inhibits the PKA antagonistic PP-1, thus causing positive feedback and augmentation of the PKA signaling pathway.
This thesis investigated whether CaMKII has a functional influence on the function of I-1 through not yet examined phosphorylation sites of I-1.
For this purpose, the wild-type variant of I-1 and various phosphomimetically active mutants of I-1 (T42D, S46D, S47D, T136D) were expressed in cardiomyocyte cell cultures from I-1 knockout mice by adenoviral gene transfer. Then target proteins of the PKA- and CaMKII-signalling pathways were examined using Western blotting.
Here the only significant effect found was a small but significant (p = 0,038) increase in PLB phosphorylation at the Ser-16 site under the influence of the I-1 S46D mutant. However, as the immediately adjacent Thr-17 site, which is also regulated by PP-1, did not show any significant change (only a minimal trend towards a minimally higher phosphorylation level), it is unclear whether this is not just a statistical fluctuation, given the large number of mutants and target proteins examined, without any functional implications. There were no indications of a strong, global influence on the target proteins studied. There was also no indication of a relevant change in CaMKII activity (assessed by CaMKII Thr-286 autophosphorylation and by PLB Thr-17 phosphorylation as a surrogate readout) by the I-1 mutants investigated.
PP-1 specific inhibitors okadaic acid and tautomycin were used in combination with a phosphatase activity assay to test whether a massive transgenic overexpression of CaMKII would impact PP-1 activity. No significant change in PP-1 activity was observed as a result of CaMKII overexpression. Hence, CaMKII does not seem to affect PP-1 activity to a substantial degree on a global cellular scale.
However, it is still possible that there could be compartmental regulation on the subcellular scale that cannot be detected in the “global” Western blot. Therefore, the I-1 Ser-46 phosphorylation appears to be an interesting candidate for further research, e.g. by separation of the subcellular fractions by centrifugation.
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