![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/application_pdf.png) | License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-555721
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.55572
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 30 January 2025 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Date of exam: | 30 January 2024 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | glaucoma, trabecular meshwork, quartz crystal microbalance, Electric Cell-Substrate Impedance Sensing, viscoelastic, hydrogels, cells, Young’s modulus, complex shear, modulus, fasudil, diffusion, vitreous body, water flux |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 55572 |
Abstract (English)
This thesis deals with different approaches of non-invasive sensing techniques to contribute to current glaucoma treatment and to also find new glaucoma treatment strategies. The main focus is turned to its most prevalent form, primary open-angle glaucoma (POAG), where mechanical alterations of trabecular meshwork (TM) cells reduce the outflow of aqueous humor and, accordingly, increase the ...
Abstract (English)
This thesis deals with different approaches of non-invasive sensing techniques to contribute to current glaucoma treatment and to also find new glaucoma treatment strategies. The main focus is turned to its most prevalent form, primary open-angle glaucoma (POAG), where mechanical alterations of trabecular meshwork (TM) cells reduce the outflow of aqueous humor and, accordingly, increase the intraocular pressure (IOP) leading to a visual nerve damage. Studies are performed on 2D cell cultures, while cellular changes are recorded by the quartz crystal microbalance (QCM), Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS), and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Since the QCM is highly sensitive to stiffness changes / viscoelastic changes, this technique is mainly used to report on the relevant mechanical alterations. ECIS is used to record cell shape changes, while most of the measurements are complemented by CLSM investigations to observe the concomitant cytoskeletal changes. In a preliminary mechanical characterization, polyacrylamide (PAAm) and polyethylene glycol (PEG) hydrogels are used as a model system for the cells. On the one hand, the hydrogels are used to establish correlations between the Young’s modulus measured by compression testing and the acoustic impedance recorded by QCM. These correlations are then used to calculate the Young’s modulus of a variety of cells from their QCM response providing results similar to those reported for atomic force microscopy (AFM). On the other hand, equations correlating the complex shear modulus with QCM parameters published by Bandey et al. are tested for hydrogels by calculation of the complex shear modulus from QCM data and comparison to values obtained from rheological measurements. Since the complex shear modulus is frequency-dependent and has not been studied in the MHz-region before, the results are plausible and in a reasonable order of magnitude. These equations are then applied to cells, which enables a way to determine complex shear moduli in the MHz-region, which is hardly accessible by other techniques. Studies on HTM-N cells, that serve as a model for the TM cells of the human eye and are treated with fasudil, reveal the suitability of this Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor for the treatment of POAG. Fasudil is demonstrated to induce a relaxation and degradation of actin filaments in HTM-N cells, as indicated by the stiffness decrease observed in QCM measurements and the morphological changes observed in ECIS measurements and CLSM imaging. This suggests a reduction of outflow resistance in the TM by fasudil, leading to an increase in aqueous humor outflow and consequently to a reduction of IOP, the main risk factor of POAG. To model the in-vivo situation of intravitreal fasudil injection followed by diffusion through the vitreous body and subsequent influence on TM cells, a transwell assay is developed in this thesis with photolithographic fabrication of the electrode arrays. This assay utilizes continuous ECIS measurements to monitor the response of HTM-N cells to fasudil as well as the retardation by diffusion through the vitreous body in transwell filter inserts. The cellular response to fasudil, as released from the vitreous body, is very similar to that obtained from a direct exposure, proving its relaxation effect even after previous diffusion. The successful performance of this transwell experiment demonstrates that it is complementary to existing organ on-a-chip devices for the investigation of POAG and also suggests using this assay to screen for other ROCK inhibitors or different kinds of drugs, or to investigate even other diseases. Additionally, osmotically triggered water flux in HTM-N cells is analyzed in this thesis. Water flux induced by osmotic gradients leads to changes of cell volume associated with changes of intracellular viscoelasticity, which makes it possible to detect water flux by QCM measurements. Results demonstrate a very fast water flux in HTM-N cells, providing the great potential to find glaucoma treatment strategies based on water flux. For example, as already suggested in literature, hypertonically induced TM cell shrinking can increase TM permeability and decrease IOP in glaucoma patients. This effect may be long-lasting since it is revealed by studying different water flux inhibitors that HTM-N cells barely exhibit regulatory volume increase processes.
Translation of the abstract (German)
Die vorliegende Doktorarbeit behandelt verschiedene Ansätze von nicht-invasiven Sensortechnologien, um zur gegenwärtigen Glaukombehandlung beizutragen und neue Strategien der Behandlung zu finden. Das Hauptaugenmerk liegt dabei auf der meist verbreiteten Glaukom-Form, dem primären Offenwinkelglaukom (POAG), wobei mechanische Änderungen von Zellen im Trabekelwerk (TM) den Abfluss des Kammerwassers ...
Translation of the abstract (German)
Die vorliegende Doktorarbeit behandelt verschiedene Ansätze von nicht-invasiven Sensortechnologien, um zur gegenwärtigen Glaukombehandlung beizutragen und neue Strategien der Behandlung zu finden. Das Hauptaugenmerk liegt dabei auf der meist verbreiteten Glaukom-Form, dem primären Offenwinkelglaukom (POAG), wobei mechanische Änderungen von Zellen im Trabekelwerk (TM) den Abfluss des Kammerwassers reduzieren, was zu einer Erhöhung des Augeninnendrucks (IOP) und zu einer Beschädigung des Sehnervs führt. Für die Untersuchungen in dieser Arbeit werden zweidimensional wachsende Zellschichten verwendet. Zelluläre Veränderungen während der experimentellen Stimuli werden mithilfe der Quarzkristallmikrowaage (QCM), der Methode des Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) und der Konfokalmikroskopie erfasst. Da die QCM hochsensitiv auf Änderungen der Steifigkeit oder der Viskoelastizität reagiert, werden die für das Glaukom relevanten mechanischen Änderungen hauptsächlich mit dieser Messtechnik aufgezeichnet. ECIS wird verwendet um Änderungen der Zellform zu detektieren, während begleitende Änderungen des Zytoskeletts konfokalmikroskopisch untersucht werden. In einer vorausgehenden mechanischen Charakterisierung werden Hydrogele aus Polyacrylamid (PAAm) und Polyethylenglycol (PEG) als Modell für die Zellen verwendet. Einerseits werden die Hydrogele verwendet, um Korrelationen zwischen dem durch Kompression gemessenen Youngschen Modul und der mit der QCM messbaren akustischen Impedanz aufzustellen. Diese Korrelationen werden dann dazu verwendet, den Youngschen Modul für verschiedene Zelltypen auf Basis ihrer QCM-Parameter zu berechnen. Die entsprechenden Ergebnisse liegen sehr nahe an Literaturwerten, die mithilfe von Rasterkraftmikroskopie (AFM) gemessen wurden. Andererseits werden von Bandey et al. publizierte Gleichungen, die den komplexen Schubmodul mit QCM-Parametern in Beziehung setzen, an den Hydrogelen getestet, indem deren komplexer Schubmodul aus QCM-Daten berechnet und mit rheologisch gemessenen Werten verglichen wird. Da der komplexe Schubmodul frequenzabhängig ist und zuvor niemals im MHz-Bereich bestimmt wurde, sind die erhaltenen Ergebnisse sinnvoll und in einer angemessenen Größenordnung. Diese Gleichungen werden dann auf Zellen angewandt, was es ermöglicht, den komplexen Schubmodul im MHz-Bereich zu bestimmen, was durch andere Methoden kaum erreichbar ist. Untersuchungen an HTM-N-Zellen, die als Modell für die TM-Zellen des menschlichen Auges dienen und mit Fasudil behandelt werden, beweisen die Eignung dieses Rho-Kinase-Inhibitors zur Behandlung des POAG. Durch eine in QCM-Messungen beobachtete Abnahme der Steifigkeit und in ECIS-Messungen beobachtete morphologische Änderungen wird gezeigt, dass Fasudil eine Entspannung und einen Abbau von Aktinfilamenten in den HTM-N-Zellen bewirkt, was konfokalmikroskopisch bestätigt wird. Dieses Ergebnis legt eine Verringerung des Widerstandes im Abflusssystem des Trabekelwerkes durch Fasudil nahe, wodurch der Abfluss des Kammerwassers verstärkt und der IOP, der Haupt-Risikofaktor des POAG, reduziert werden würde. Die physiologische Situation einer intravitrealen Injektion von Fasudil, gefolgt von einer Diffusion durch den Glaskörper und einer anschließenden Beeinflussung der TM-Zellen, sollte nachgeahmt werden. Dafür wird in dieser Arbeit ein neuer Transwell-Assay entwickelt, wobei die Elektroden-Arrays photolithographisch hergestellt werden. Dabei wird sowohl die Reaktion von HTM-N-Zellen auf Fasudil als auch die Verzögerung, die durch Diffusion durch den in Transwell-Filtereinsätzen gehaltenen Glaskörper verursacht wird, durch ECIS-Messungen zeitaufgelöst verfolgt. Die Zellantwort auf Fasudil, das durch den Glaskörper diffundiert, ist der einer direkten Stimulierung sehr ähnlich, was dessen relaxierenden Effekt auch nach vorheriger Diffusion nachweist. Die erfolgreiche Durchführung dieser Transwell-Experimente zeigt, dass dieser Assay komplementär zu bestehenden Organ-on-a-Chip-Ansätzen zur Untersuchung des POAG ist, und empfiehlt auch den Einsatz dieses Assays für die Suche nach weiteren Rho-Kinase-Inhibitoren und anderen Arten von Medikamenten, und sogar für die Untersuchung von anderen Krankheiten. Zusätzlich wird in dieser Arbeit der osmotisch ausgelöste Wasserfluss in HTM-N-Zellen untersucht. Der durch osmotische Gradienten induzierte Wasserfluss hängt mit Änderungen des Zellvolumens und der intrazellulären Viskoelastizität zusammen, was eine Detektion mit der QCM ermöglicht. Die erzielten Ergebnisse zeigen einen sehr schnellen Wasserfluss in HTM-N-Zellen auf, was die großartige Möglichkeit bietet, Strategien der Glaukombehandlung zu finden, die auf Wasserfluss basieren. Zum Beispiel, wie es bereits in der Literatur vorgeschlagen wurde, könnte ein hyperton ausgelöstes Schrumpfen der TM-Zellen die Durchlässigkeit des Trabekelwerks erhöhen und den IOP in Glaukom-Patienten senken. Dieser Effekt könnte langanhaltend sein, da in Untersuchungen von verschiedenen Wasserfluss-Inhibitoren gezeigt wird, dass HTM-N-Zellen kaum regulatorische Prozesse zur Volumenerhöhung aufweisen.
Metadata last modified: 30 Jan 2025 06:27
Owner only: item control page
Download Statistics