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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-586555
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.58655
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 23 July 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 8 July 2024 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | enzymology, protein biochemistry, protein-protein interactions, antibiotics, folate biosynthesis, tryptophan biosynthesis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 58655 |
Abstract (English)
Glutamine amidotransferases are responsible for the incorporation of ammonia into a variety of metabolites of primary and secondary metabolism. They minimally consist of a glutaminase subunit, which abstracts ammonia from glutamine, and a synthase subunit, which incorporates the generated ammonia into a specific substrate. To avoid the unproductive hydrolysis of glutamine, the activity of the ...
Abstract (English)
Glutamine amidotransferases are responsible for the incorporation of ammonia into a variety of metabolites of primary and secondary metabolism. They minimally consist of a glutaminase subunit, which abstracts ammonia from glutamine, and a synthase subunit, which incorporates the generated ammonia into a specific substrate. To avoid the unproductive hydrolysis of glutamine, the activity of the glutaminase is controlled by the synthase and, in some cases, by additional allosteric substrates or ligands.
In the first part of this thesis, the molecular mechanism of the glutamine amidotransferase aminodeoxychorismate synthase (ADCS), which catalyses the first step of folate biosynthesis, is examined. To elucidate the mechanism of the glutaminase PabA in conjunction with the synthase PabB, an X-ray crystal structure of the isolated PabA subunit and four structures of the PabA-PabB complex in various catalytic states were determined. Furthermore, a thorough mutational analysis was conducted by determining the catalytic activity and complex affinity of selected protein variants. These experiments indicated that a catalytically competent orientation of residues in the active site of PabA is adopted only in the presence of PabB. Within the PabA-PabB complex, the formation of the covalent glutamyl-thioester reaction intermediate at the active site of PabA induces a relative rotational movement of PabB by 23°, which results in an expansion of the PabA-PabB interface and an apparent closure of the complex. As demonstrated by analytical gel filtration and isothermal titration calorimetry experiments, the closure of the complex is accompanied by a stabilization of the PabA-PabB complex. Moreover, steady-state kinetics revealed that the closed complex state facilitates the direct participation of PabB residues in a shared and secluded glutamine binding pocket. The ADCS complex thus can adopt at least two states: An open state allowing the binding of glutamine and a closed state promoting the solvent-excluded hydrolysis of glutamine as well as the transport of reactive ammonia to the active site of the synthase.
The second part of this thesis deals with the validation of ADCS and anthranilate synthase (AS) as novel targets for antibacterial compounds that promise high robustness against resistance-mediating mutations. The two evolutionary related glutamine amidotransferase complexes are required for the biosynthesis of folate and tryptophan in most prokaryotic organisms. The catalytic activities of both enzymes rely on the interplay of a glutaminase and a synthase subunit that is conferred by a highly conserved subunit interface. Consequently, inhibiting subunit association in both enzymes by one competing bispecific inhibitor has the potential to suppress bacterial proliferation. Two conserved interface hotspot residues were verified in silico and in vitro as potential inhibitor binding sites by demonstrating their crucial role in subunit association and enzymatic activity via computational alanine scanning, analytical gel filtration and steady-state activity titrations. For in vivo target validation, genomically modified Escherichia coli strains were generated, in which subunit association was disrupted by modifying these central interface residues. The growth of such strains was drastically impeded on liquid and solid minimal medium due to the lack of folate and tryptophan. Remarkably, the bacteriostatic effect was observed even in the presence of heat-inactivated human plasma, demonstrating that accessible host metabolite concentrations do not compensate for the lack of folate and tryptophan within the tested bacterial cells. In conclusion, a potential inhibitor targeting both enzyme complexes will be effective against a broad spectrum of pathogens and offer increased resilience against antibiotic resistance.
In summary, this thesis expands the knowledge on glutamine amidotransferases by a detailed mechanistic characterization of the ADCS enzyme complex and offers a clinical application of these insights through the validation of ADCS and AS as antibiotic targets.
Translation of the abstract (German)
Glutamin-Amidotransferasen sind für den Einbau von Ammoniak in eine Vielzahl von Metaboliten des Primär- und Sekundärstoffwechsels verantwortlich. Sie bestehen mindestens aus einer Glutaminase-Untereinheit, die Ammoniak von Glutamin abstrahiert, und einer Synthase-Untereinheit, die den entstandenen Ammoniak in ein spezifisches Substrat einbaut. Um dabei die unproduktive Hydrolyse von Glutamin zu ...
Translation of the abstract (German)
Glutamin-Amidotransferasen sind für den Einbau von Ammoniak in eine Vielzahl von Metaboliten des Primär- und Sekundärstoffwechsels verantwortlich. Sie bestehen mindestens aus einer Glutaminase-Untereinheit, die Ammoniak von Glutamin abstrahiert, und einer Synthase-Untereinheit, die den entstandenen Ammoniak in ein spezifisches Substrat einbaut. Um dabei die unproduktive Hydrolyse von Glutamin zu vermeiden, wird die Glutaminase-Aktivität durch die Synthase und in einigen Fällen durch zusätzliche allosterisch wirkende Substrate oder Liganden gesteuert.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird der molekulare Mechanismus der Glutamin-Amidotransferase Aminodeoxychorismat-Synthase (ADCS), die den ersten Schritt in der Biosynthese von Folat katalysiert, beleuchtet. Um den Mechanismus der Glutaminase PabA im Zusammenspiel mit der Synthase PabB aufzuklären, wurde eine Röntgenkristallstruktur der isolierten PabA-Untereinheit und vier Strukturen des PabA-PabB-Komplexes in verschiedenen katalytischen Stadien aufgenommen. Außerdem wurden in einer umfangreichen Mutationsanalyse die katalytische Aktivität und Komplexaffinität von ausgewählten Proteinvarianten untersucht. Diese Experimente wiesen darauf hin, dass eine katalytisch kompetente Ausrichtung der Residuen im aktiven Zentrum von PabA erst in Anwesenheit von PabB erfolgt. Im PabA-PabB-Komplex induziert die Bildung des kovalenten Glutamyl-Thioester-Reaktionsintermediates am aktiven Zentrum von PabA eine relative Rotationsbewegung von PabB um 23°, die eine Vergrößerung der Kontaktfläche zwischen PabA und PabB und eine apparente Schließbewegung des Komplexes zur Folge hat. Experimentelle Untersuchungen mittels analytischer Gelfiltration und isothermer Titrationskalorimetrie zeigten, dass die Schließung des Komplexes mit einer Stabilisierung des PabA-PabB-Komplexes einhergeht. Zudem erwiesen Steady-State-Kinetiken, dass im geschlossenen Komplex die direkte Beteiligung von PabB-Residuen an einer gemeinsamen, nach außen abgeschlossenen Glutamin-Bindetasche ermöglicht wird. Der ADCS-Komplex kann also mindestens zwei Zustände einnehmen: Eine offene Form, die die Bindung von Glutamin erlaubt, und eine geschlossene Form, in der unter Lösungsmittel-Ausschluss Glutamin hydrolysiert und der reaktive Ammoniak zum aktiven Zentrum der Synthase transportiert wird.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Validierung der ADCS und der Anthranilat-Synthase (AS) als neue Targets für antibakterielle Wirkstoffe, die eine hohe Beständigkeit gegenüber resistenzvermittelnden Mutationen versprechen. Die beiden evolutionär verwandten Glutamin-Amidotransferase-Komplexe sind in den meisten Bakterien essenziell für die Biosynthese von Folat und Tryptophan und die katalytischen Aktivitäten beider Enzyme beruhen auf dem Zusammenspiel einer Glutaminase- und einer Synthase-Untereinheit, das durch eine hoch-konservierte Kontaktfläche vermittelt wird. Eine Hemmung der Assoziation der Untereinheiten in beiden Enzymen durch einen konkurrierenden bi-spezifischen Inhibitor hat daher das Potenzial, bakterielles Wachstum zu unterdrücken. Zwei konservierte Hotspot-Residuen der Kontaktfläche wurden in silico und in vitro als potenzielle Inhibitor-Bindestellen verifiziert, indem ihre maßgebliche Rolle bei der Komplexbildung und der enzymatischen Aktivität über computerbasierte Alanin-Scans, analytische Gelfiltration und Steady-State- Aktivitätstitrationen nachgewiesen wurde. Für eine in vivo Target-Validierung wurden genomisch veränderte Escherichia coli-Stämme erzeugt, bei denen die Assoziation der Untereinheiten durch eine Modifikation dieser zentralen Reste gestört wurde. Das Wachstum solcher Stämme auf flüssigem und festem Minimalmedium war aufgrund eines Mangels an Folat und Tryptophan drastisch verzögert. Die bemerkenswerte Beständigkeit dieses Effekts sogar in der Anwesenheit von hitzeinaktiviertem humanem Plasma demonstriert, dass die verfügbaren Metabolit-Konzentrationen im Wirt den Mangel an Folat und Tryptophan in den getesteten bakteriellen Zellen nicht kompensieren können. Ein potenzieller Inhibitor, der auf beide Enzymkomplexe abzielt, wird also gegen ein breites Spektrum von Krankheitserregern wirksam sein und eine erhöhte Resilienz gegen Antibiotika-Resistenzen aufweisen.
Zusammenfassend erweitert die vorliegende Arbeit das Verständnis über Glutamin-Amidotransferasen durch eine detaillierte mechanistische Charakterisierung des ADCS-Enzymkomplexes und bietet eine klinische Anwendung dieses Wissens durch die Validierung von ADCS und AS als Antibiotika-Targets.
Metadata last modified: 23 Jul 2024 11:40
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