Hintergrund: Vorangegangene Experimente unserer Arbeitsgruppe zeigten eine erhöhte Konzentration von 2-Hydroxyglutarat (2-HG) sowie eine Häufung regulatorischer T-Zellen (Treg) in klarzelligen Nierenzellkarzinomen (ccRCC). Um die Relevanz dieser Beobachtungen für die Prognose der ccRCC Patienten herauszuarbeiten, wurde eine TCGA-Analyse durchgeführt. Hierbei ließ sich ein Überlebensvorteil für ccRCC Patienten mit hoher Expression der L-2-HG-Dehydrogenase (L-2-HG-DH) vermerken. Weiterhin imponierte eine inverse Korrelation zwischen der Expression von L-2-HG-DH und FOXP3. Diese Beobachtungen führten zu der Hypothese, dass 2-HG über die Induktion regulatorischer T-Zellen zu einem immunsuppressiven TME beiträgt und so den Tumorprogress des ccRCC begünstigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit können neue Erkenntnisse für die Entwicklung alternativer Therapiestrategien zur Behandlung des ccRCC erbringen und im Hinblick auf eine potentielle Induktion regulatorischer T-Zellen auch Anwendung in der Prävention und Therapie unerwünschter Immunreaktionen finden.

Methoden: Das Ziel dieser experimentellen Arbeit war, eine Modulation der Immunantwort durch 2-HG im Kontext des ccRCC zu untersuchen. Der Schwerpunkt lag dabei in der Untersuchung der FOXP3-Expression von CD4+ T-Zellen nach einer Behandlung mit 2-HG. Hierfür wurden naive CD4+ T-Zellen aus dem peripheren Blut gesunder Probanden isoliert, in vitro in Th0-, Th1- sowie Treg-ähnliche Zellen differenziert und mit 2-HG inkubiert. Zur Untersuchung enantiomerspezifischer Phänomene führten wir eine Inkubation sowohl mit D- als auch L-2-HG durch. Wir überprüften außerdem, ob sich die beobachteten Effekte auch in tumorinfiltrierenden CD4+ T-Lymphozyten (TILs) ex vivo reproduzierten. Da ein relevanter Teil der CD4+ T-Zellen kein FOXP3 exprimiert, wurden im Rahmen dieser Arbeit weitere tolerogene Effekte von 2-HG überprüft und neben der Expression der immunregulierenden Moleküle PD-1 und CD147 der Sauerstoffverbrauch der CD4+ T-Zellen thematisiert.

Ergebnisse: Über eine Inkubation mit L-2-HG konnten wir eine verstärkte FOXP3-Expression in CD4+ T-Zellen erzielen. Bemerkenswerterweise konnte ein Anstieg des Quotienten CD4+ FOXP3+/CD4+ nicht nur innerhalb der Treg-ähnlichen Subpopulation, sondern auch in Th0- und Th1-ähnlichen Zellen vermerkt werden. Obwohl der Anteil regulatorischer T-Zellen im renalen Tumorgewebe bereits initial erhöht war, führte die Behandlung mit L-2-HG auch in CD4+ TILs zu einem signifikanten Anstieg der FOXP3-Expression. Die FOXP3-Induktion in CD4+ T-Zellen war dabei nicht an eine gesteigerte Aktivierung gekoppelt. Dennoch ließ sich ein unspezifischer, proliferationsstimulierender Effekt von 2-HG beobachten. In Treg-ähnlichen Zellen bewirkte die Inkubation mit L-2-HG außerdem einen erhöhten Sauerstoffverbrauch. CD4+ TILs aus dem renalen Tumorgewebe wiesen bereits vor Inkubation mit 2-HG eine signifikant erhöhte PD-1- und CD147-Expression auf. Interessanterweise führte die Behandlung mit L-2-HG zu einem weiteren Anstieg der Expression von PD-1 in CD4+ TILs. Für CD4+ T-Zellen gesunder Spender wiederum konnte im Falle einer Inkubation mit L-2-HG sowohl eine Induktion von PD-1 als auch CD147 festgestellt werden. In unseren Experimenten präsentierte sich L-2-HG als potenteres Enantiomer. Im Rahmen der Charakterisierung des Immuninfiltrats im ccRCC zeigte sich außerdem eine signifikante Häufung von CD4+/CD8+ dp T-Zellen.

Perspektive: Zukünftige Experimente sollten die funktionellen Implikationen der L-2-HG-vermittelten FOXP3-Induktion in CD4+ T-Zellen untersuchen. Dabei sollte insbesondere die regulatorische Aktivität, beispielsweise anhand der Produktion anti-inflammatorisch wirksamer Zytokine überprüft und so eine gesteigerte FOXP3-Expression in Th0- und Th1-ähnlichen Zellen als Resultat einer Differenzierung zu Treg verifiziert werden. Weiterhin sollten die Konsequenzen einer Induktion von PD-1 und CD147 in CD4+ T-Zellen für die antitumorale Immunantwort adressiert werden. In Anbetracht einer signifikanten Häufung von CD4+/CD8+ dp T-Zellen und des bislang unvollständigen Verständnisses über ihre Funktion sollte dieser Immunzell-Subpopulation besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden.

Background: Previous experiments of our research group showed an increased concentration of 2-hydroxyglutarate (2-HG) and an accumulation of regulatory T cells (Treg) in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). To determine the relevance of these observations for the prognosis of ccRCC patients, a TCGA analysis was performed. This revealed a survival advantage for ccRCC patients with high expression of L-2-HG-dehydrogenase (L-2-HG-DH). Furthermore, there was an inverse correlation between the expression of L-2-HG-DH and FOXP3. These observations led to the hypothesis that 2-HG contributes to an immunosuppressive TME via the induction of regulatory T cells and thus promotes tumour progression in ccRCC. The results of this work may provide new insights for the development of alternative therapeutic strategies for the treatment of ccRCC and, with regard to a potential induction of regulatory T cells, may also find application in the prevention and therapy of undesired immune reactions.

Methods: The aim of this experimental work was to investigate the modulation of the immune response by 2-HG in the context of ccRCC. The focus was on the investigation of FOXP3 expression of CD4+ T cells after treatment with 2-HG. For this purpose, naive CD4+ T cells were isolated from the peripheral blood of healthy volunteers, differentiated in vitro into Th0-, Th1- and Treg-like cells and incubated with 2-HG. To investigate enantiomer-specific phenomena, we carried out incubation with both D- and L-2-HG. We also checked whether the observed effects were also reproduced ex vivo in tumour-infiltrating CD4+ T lymphocytes (TILs). Since a relevant proportion of CD4+ T cells do not express FOXP3, further tolerogenic effects of 2-HG were examined in this study and, in addition to the expression of the immunoregulatory molecules PD-1 and CD147, the oxygen consumption of CD4+ T cells was also analysed.

Results: Via incubation with L-2-HG, we were able to achieve increased FOXP3 expression in CD4+ T cells. Remarkably, an increase in the CD4+ FOXP3+/CD4+ ratio was observed not only within the Treg-like subpopulation, but also in Th0- and Th1-like cells. Although the proportion of regulatory T cells in renal tumour tissue was already initially increased, treatment with L-2-HG also led to a significant increase in FOXP3 expression in CD4+ TILs. The FOXP3 induction in CD4+ T cells cells was not coupled to increased activation. Nevertheless, a non-specific, proliferation-stimulating effect of 2-HG was observed. In Treg-like cells, incubation with L-2-HG also resulted in increased oxygen consumption. CD4+ TILs from renal tumour tissue showed significantly increased PD-1 and CD147 expression even before incubation with 2-HG. Interestingly, treatment with L-2-HG led to a further increase in the expression of PD-1 in CD4+ TILs. For CD4+ T cells from healthy donors, on the other hand in turn, an induction of both PD-1 and CD147 was observed when incubated with L-2-HG. In our experiments, L-2-HG proved to be a more potent enantiomer. Characterisation of the immune infiltrate in ccRCC also revealed a significant accumulation of CD4+/CD8+ dp T cells.

Perspective: Future experiments should investigate the functional implications of L-2-HG-mediated FOXP3 induction in CD4+ T cells. In particular, the regulatory activity, for example by means of the production of anti-inflammatory cytokines, should be examined and thus an increased FOXP3 expression in Th0- and Th1-like cells as a result of differentiation to Treg should be verified. Furthermore, the consequences of an induction of PD-1 and CD147 in CD4+ T cells for the antitumour immune response should be addressed. In view of the significant accumulation of CD4+/CD8+ dp T cells and the incomplete understanding of their function, special attention should be paid to this immune cell subpopulation.