Ziel: Eine qPCR-Anwendung, mit der genomische Amplifikationen in Einzelzellen bestimmt werden können, soll aufbauend auf der Vorarbeit von Hoffmann/Pasch weiterentwickelt und evaluiert werden: als weitere Zielgene sollen EGFR, MET und FGFR1 etabliert werden. Durch Vereinfachung des Aufbaus, Kostensenkung, Verkürzung der Messzeit und Automatisierung soll eine bessere Eignung zum Einsatz in der ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel: Eine qPCR-Anwendung, mit der genomische Amplifikationen in Einzelzellen bestimmt werden können, soll aufbauend auf der Vorarbeit von Hoffmann/Pasch weiterentwickelt und evaluiert werden: als weitere Zielgene sollen EGFR, MET und FGFR1 etabliert werden. Durch Vereinfachung des Aufbaus, Kostensenkung, Verkürzung der Messzeit und Automatisierung soll eine bessere Eignung zum Einsatz in der Klinik erreicht werden.
Methoden: Für die Gene EGFR, MET und FGFR1 werden Hydrolysesonden/Primerpaare erstellt und auf ihre Eignung für eine Multiplex-Reaktion getestet. Die qPCR-Anwendung wird evaluiert mit Zelllinienzellen, deren Amplifikationsstatus mittels Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung bestimmt wird. Zur Bestimmung des Amplifikationsstatus von einzelnen Zellen werden zwei Kollektive aus Lymphknotenzellen/Knochenmarkzellen von Patientenproben aufgestellt: Im "Normalzellkollektiv" befinden sich Zellen, die sich für die Marker EpCAM bzw. Zytokeratin nicht anfärben. Das "Tumorzellkollektiv" besteht aus Zellen von Patienten mit Nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom, die sich für die Marker EpCAM bzw. Zytokeratin stark anfärben. Ein Pipettierroboter wurde zur Eignung für die qPCR geprüft und die Pipettierung automatisiert. Alle Schritte zur Datenverarbeitung und Berechnung der Ergebnisse wurden weitgehend automatisiert und eine graphische Benutzeroberfläche programmiert.
Ergebnisse: Die Ergebnisse der qPCR-Anwendung korrelieren gut mit FISH-Ergebnissen (Pearson’s R: EGFR 0,94; MET 0,88; ERBB2 0,98; FGFR1 0,94). Der Aufbau als Dreifach-Multiplex senkt Kosten und Zeit auf etwa ein Drittel. Durch Automatisierung der Pipettierung und Datenverarbeitung ist die Anwendung unabhängig vom anwendenden Nutzer. Das Tumorzellkollektiv von 109 Zellen weist mit 19 % für EGFR, 16 % MET, 25 % ERBB2 signifikant mehr Amplifikationen auf als das Normalzellkollektiv mit 210 Zellen (jeweils 4-5% amplifiziert). In Adenokarzinomen beträgt die Prävalenz von Amplifikationen: 26 % EGFR, 20 % MET, 30 % ERBB2, 7 % FGFR1. Plattenepithelkarzinome weisen tendenziell häufiger Amplifikationen für FGFR1 auf: 5% EGFR, 8% MET, 14% ERBB2, 19 % FGFR1. (Unterschiede Adenokarzinom vs. Plattenepithelkarzinom jeweils nicht signifikant.) Im Vergleich von Punktionen von klinischem Status N1-2 zu N0 weisen Zellen aus N1-2 mit einer Prävalenz von 37 % signifikant häufiger Amplifikationen für EGFR auf, während N0-Zellen mit 22 % häufiger Amplifikationen für FGFR1 aufweisen. Bei 8 Patienten wurden Lymphknoten- und Knochenmarkzellen gleichzeitig gemessen. In 3 Patienten wurden die selben Amplifikationen sowohl in Lymphknoten- als auch Knochenmarkzellen gefunden.
Schlussfolgerung: Die vorgestellte qPCR-Anwendung eignet sich für einen klinischen Einsatz zur Bestimmung von Amplifikationen in Einzelzellen. Amplifikationen in einem Kollektiv aus Zellen von Patienten mit NSCLC decken sich soweit vergleichbar mit Literaturangaben.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Objective: The aim is to further develop and evaluate a qPCR application, based on the work of Hoffmann/Pasch, for determining genomic amplifications in individual cells. The aim is to establish additional target genes: EGFR, MET, and FGFR1. By simplifying the setup, reducing costs, shortening the measurement time, and automating the process, the application's suitability for clinical use should ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Objective: The aim is to further develop and evaluate a qPCR application, based on the work of Hoffmann/Pasch, for determining genomic amplifications in individual cells. The aim is to establish additional target genes: EGFR, MET, and FGFR1. By simplifying the setup, reducing costs, shortening the measurement time, and automating the process, the application's suitability for clinical use should be improved.
Methods: Hydrolysis probes/primer pairs are created for the genes EGFR, MET and FGFR1 and tested for their suitability in a multiplex-PCR. The qPCR application is evaluated using cell line cells, whose amplification status is determined by Fluorescence In-Situ Hybridization. To determine the amplification status of individual cells, two collectives are set up from lymph node cells/bone marrow cells from patient samples: The "normal cell collective" contains cells that do not stain for the markers EpCAM or cytokeratin. The "tumor cell collective" consists of cells from patients with Non-Small Cell Lung Cancer which strongly stain for the markers EpCAM or cytokeratin. A pipetting robot has been tested for suitability for qPCR and the pipetting automated. All steps for data processing and calculation of results have been largely automated and a graphical user interface has been programmed.
Results: The results of the qPCR application correlate well with FISH results (Pearson’s R: EGFR 0.94; MET 0.88; ERBB2 0.98; FGFR1 0.94). The setup as a triple multiplex PCR reduces costs and time to approximately one third. Through automation of pipetting and data processing, the application is independent of the user. The tumor cell collective of 109 cells shows a significantly higher proportion of amplifications for each target gene: EGFR (19%), MET (16%), ERBB2 (25%) compared to the normal cell collective with 210 cells (each 4-5% amplified). In adenocarcinomas, the prevalence of amplifications is: 26% EGFR, 20% MET, 30% ERBB2, 7% FGFR1. Squamous cell carcinomas tend to have a higher frequency of FGFR1 amplifications: 5% EGFR, 8% MET, 14% ERBB2, 19% FGFR1. (The differences between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma are not statistically significant.) In patients with N1-2 status compared to N0 status, 37% of cells show a significantly higher prevalence of EGFR amplifications, while N0 cells more frequently have FGFR1 amplifications at 22%. In 8 patients, both lymph node and bone marrow cells were measured simultaneously. The same amplifications were found in both lymph node and bone marrow cells in 3 of these patients.
Conclusion: The presented qPCR application is suitable for clinical use in determining amplifications in individual cells. Amplifications in a collective of cells from patients with NSCLC align, to the extend comparable, with literature references.
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