![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/application_pdf.png) | Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International PDF - Veröffentlichte Version (71MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-747439
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.74743
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 15 Januar 2026 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Christoph Klein |
| Tag der Prüfung: | 14 Januar 2025 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren |
| Stichwörter / Keywords: | Brustkrebs, Disseminierte Krebszellen (DCC), EpCAM |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 74743 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Hintergrund: Metastasengründende disseminierte Tumorzellen (DCCs) stellen ein wichtiges Ziel in der Tumorforschung dar. Obwohl ihre Präsenz im Körper mit einer schlechteren Prognose und einer erhöhten Rückfallwahrscheinlichkeit assoziiert ist, gibt es bisher keine spezifischen therapeutischen Konzepte zu ihrer Behandlung. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung solcher Behandlungsansätze ist die ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Hintergrund: Metastasengründende disseminierte Tumorzellen (DCCs) stellen ein wichtiges Ziel in der Tumorforschung dar. Obwohl ihre Präsenz im Körper mit einer schlechteren Prognose und einer erhöhten Rückfallwahrscheinlichkeit assoziiert ist, gibt es bisher keine spezifischen therapeutischen Konzepte zu ihrer Behandlung. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung solcher Behandlungsansätze ist die zuverlässige Erkennung dieser DCCs. Es ist bekannt, dass das epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM), das häufig als Marker zur Identifizierung von DCCs genutzt wird, auch einige nicht-kanzeröse Zellen (NCCs) im Knochenmark detektiert. Um dieses Problem anzugehen, hat unsere Forschungsgruppe diese Zellen genau charakterisiert. Basierend auf früheren RNA-Sequenzierungsdaten wurden die Immunmarker CD27 und CD319 (=SLAMF7) ausgewählt, um EpCAM+ DCCs von EpCAM+ NCCs zu unterscheiden. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Zellen basierend auf ihrer EpCAM- und CD45-Expression in DCCs und NCCs zu klassifizieren. Es wurde festgestellt, dass Zellen mit EpCAM hoch/CD45+ (vermutlich NCCs) signifikant häufiger die Immunmarker CD27 und CD319 exprimieren als Zellen mit EpCAM hoch/CD45- (vermutlich DCCs).
Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunfluoreszenzfärbung mit EpCAM und CD27/CD319 an Knochenmarksproben von 33 M0-Patienten sowie an sechs Proben von gesunden Spendern angewendet. Die Marker CD27 und CD319 wurden mit demselben Fluorochrom markiert und in demselben Mikroskopkanal analysiert. Die beiden Marker wurden auch in den nachfolgenden Analysen zusammengefasst. Insgesamt wurden 37 EpCAM+/CD27, 319- Zellen (potenzielle DCCs) und 50 EpCAM+/CD27, 319+ Zellen (potenzielle NCCs) aus den M0-Patienten isoliert. Zusätzlich wurden fünf EpCAM+/CD27, 319+ Zellen aus gesunden Spendern sowie EpCAM-/CD27, 319+ Zellen (potenzielle Immunzellen) aus jeder Probe isoliert, um als Kontrollzellen in der Studie zu dienen. Anschließend wurde die Genexpressionsprofilierung mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) an den Markertranskripten EpCAM, CD27, CD319 sowie an zuvor identifizierten DCC-spezifischen (AHSP und CA1) und NCC-spezifischen (AHNAK und JUN) Transkripten durchgeführt. Mit Hilfe der in der qPCR verwendeten Gene wurden die Zellen in DCCs, NCCs und nicht eindeutig klassifizierbare Zellen (als undefiniert beschrieben) eingeteilt. Die anschließende Analyse von Kopienzahlveränderungen (CNA) mittels Low-Pass-Sequenzierung sollte die Eignung von CD27 und CD319 zur Unterscheidung von DCCs und NCCs testen. Nur Proben mit σ∆* < 0,2 wurden qualitativ als geeignet angesehen und in die weiteren Analysen einbezogen. Die bioinformatische Auswertung basierte darauf, das Genom in Abschnitte von 500 Kilobasen (kb) zu unterteilen. Eine Abweichung musste mindestens 25 Abschnitte umfassen, damit die Probe als aberrant und damit als potenzieller DCC angesehen wurde.
Ergebnisse: Mithilfe der qPCR wurde festgestellt, dass EpCAM+/CD27, 319- Zellen signifikant häufiger DCC-spezifische Signaturgene exprimierten als EpCAM+/CD27, 319+ Zellen (p=0,002). Letztere ähnelten auf Transkriptebene stärker den EpCAM- Immunzellen der Kontrollgruppe und exprimierten NCC-spezifische Signaturgene (p=1). Nach strengen Qualitätskontrollen konnten nur ein Fünftel der ursprünglich isolierten Zellen in die CNA-Analyse einbezogen werden. Zellen mit einem EpCAM+ Phänotyp wiesen in 100 % der Fälle ein balanciertes Genom auf. Auch Zellen mit einer DCC- oder NCC-spezifischen Signatur zeigten konsistent ein balanciertes Genom. Unerwarteterweise zeigten die EpCAM- Immunzellen in 18,2 % der Fälle ein aberrantes Genom. Interessanterweise konnten die aberranten Zellen nur einer undefinierten Signatur in der qPCR zugeordnet werden. Betrachtet man die qPCR-Ergebnisse, so ist ebenfalls bemerkenswert, dass 39,0 % der EpCAM- Immunzellen undefiniert blieben. Für die Immunfluoreszenzfärbung mit EpCAM und CD27/319 wurde eine Spezifität von 74,3 % und ein negativer Vorhersagewert von 92,8 % berechnet.
Fazit: Die Immunfluoreszenzfärbung mit EpCAM und CD27/CD319 eignet sich daher gut, um unerwünschte NCCs auszuschließen, jedoch nicht für die spezifische Identifizierung von DCCs. Die Tatsache, dass nur EpCAM- Immunzellen oder Zellen mit einer undefinierten Signatur in der qPCR ein aberrantes Genom zeigten, deutet darauf hin, dass die Detektion von DCCs auf der Grundlage von EpCAM allein nicht ausreichend ist, da eine große Population von Krebszellen unentdeckt bleibt. Um EpCAM+ DCCs spezifischer zu detektieren, sollte ein zusätzliches Markerprotein für die Fluoreszenzmikroskopie etabliert werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Background: Metastasis-founding disseminated cancer cells (DCCs) are a critical target in tumor research. Despite their presence being associated with worse prognosis and increased recurrence risk, there are still no specific therapeutic concepts for their treatment. A major challenge in developing such therapies is the reliable detection of these DCCs. It is known that the epithelial cell ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Background: Metastasis-founding disseminated cancer cells (DCCs) are a critical target in tumor research. Despite their presence being associated with worse prognosis and increased recurrence risk, there are still no specific therapeutic concepts for their treatment. A major challenge in developing such therapies is the reliable detection of these DCCs. It is known that the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), frequently used as a marker for identifying DCCs, also detects some non-cancer cells (NCCs) in the bone marrow. To address this issue, our research group has closely characterized these cells. Based on previous RNA sequencing data, the immune markers CD27 and CD319 (=SLAMF7) were selected to differentiate EpCAM+ DCCs from EpCAM+ NCCs. Using flow cytometry, cells were classified into DCCs and NCCs based on their EpCAM and CD45 expression. Cells with an EpCAM high/CD45+ phenotype (presumably NCCs) were found to express the immune markers CD27 and CD319 significantly more often than cells with an EpCAM high/CD45- phenotype (presumably DCCs).
Methods: In this study, EpCAM and CD27/CD319 immunofluorescence staining was applied to bone marrow samples from 33 M0 patients and six samples from healthy donors. The markers CD27 and CD319 were labeled with the same fluorochrome and analyzed in the same microscope channel. The two markers were also grouped together in subsequent analyses. A total of 37 EpCAM+/CD27,319- cells (potential DCCs) and 50 EpCAM+/CD27,319+ cells (potential NCCs) were isolated from M0 patients, as well as five EpCAM+/CD27,319+ cells from healthy donors. Additionally, EpCAM-/CD27,319+ cells (potential immune cells) were isolated from each sample to serve as control cells during the study. These cells were then subjected to gene expression profiling using quantitative real-time PCR (qPCR) on the marker transcripts EpCAM, CD27, and CD319, as well as previously identified DCC-specific transcripts (AHSP and CA1) and NCC-specific transcripts (AHNAK and JUN). Using the genes analyzed in qPCR, the cells were classified as DCCs, NCCs, or undefined (for cells that could not be clearly categorized). A subsequent copy number alteration (CNA) analysis via low-pass sequencing was performed to test the suitability of CD27 and CD319 to distinguish DCCs from NCCs. Only samples with σ∆* < 0.2 were considered to be of sufficient quality and included in further analyses. The bioinformatic evaluation divided the genome into bins of 500 kilobases (kb). An aberration had to include at least 25 bins for a sample to be classified as aberrant and thus a potential DCC.
Results: Using qPCR, it was observed that EpCAM+/CD27,319- cells expressed DCC-specific signature genes significantly more frequently than EpCAM+/CD27,319+ cells (p=0.002). The latter were more similar to EpCAM- immune cells in the control group at the transcript level and expressed NCC-specific signature genes (p=1). After stringent quality controls, only one-fifth of the initially isolated cells were included in the CNA analysis. Cells with an EpCAM+ phenotype consistently exhibited a balanced genome in 100% of cases. Likewise, cells with a DCC- or NCC-specific signature showed a balanced genome. Unexpectedly, EpCAM- immune cells exhibited an aberrant genome in 18.2% of cases. Interestingly, aberrant cells could only be assigned an undefined signature in qPCR. Additionally, 39.0% of the EpCAM- immune cells remained undefined in the qPCR results. For the EpCAM and CD27/319 immunofluorescence staining, specificity was calculated as 74.3% and the negative predictive value as 92.8%.
Conclusion: The EpCAM and CD27/CD319 immunofluorescence staining is therefore suitable for excluding unwanted NCCs but not for the specific identification of DCCs. The fact that only EpCAM- immune cells or cells with an undefined signature in qPCR showed an aberrant genome suggests that detecting DCCs based on EpCAM alone is insufficient, leaving a large population of cancer cells undetected. To improve the specific detection of EpCAM+ DCCs, an additional marker protein should be established for fluorescence microscopy.
Metadaten zuletzt geändert: 15 Jan 2026 06:42
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