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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-765702
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.76570
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 15 April 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Selim Corbacioglu |
| Tag der Prüfung: | 25 März 2025 |
| Institutionen: | Medizin > Abteilung für Pädiatrische Hämatologie, Onkologie und Stammzelltransplantation |
| Stichwörter / Keywords: | 3D model; CSC; RIST; cancer stem cells; neuroblastoma; high-risk; spheroids; three-dimensional. |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 76570 |
Zusammenfassung (Englisch)
Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumor in childhood. Despite intensive treatment regimens the outcome for patients with high-risk relapsed or treatment refractory NB remains poor and novel treatment strategies are urgently needed. A new multimodal treatment design based on metronomically combining molecular targeted biologicals (Rapamycin and Dasatinib) with conventional ...
Zusammenfassung (Englisch)
Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumor in childhood. Despite intensive treatment regimens the outcome for patients with high-risk relapsed or treatment refractory NB remains poor and novel treatment strategies are urgently needed. A new multimodal treatment design based on metronomically combining molecular targeted biologicals (Rapamycin and Dasatinib) with conventional cytostatics (Irinotecan and Temozolomid), called RIST therapy, was evaluated in a prospective randomized phase II clinical trial in relapsed and refractory NB patients (RIST-rNB-2011, NCT01467986) and demonstrated a significant impact on progression-free survival and overall survival in patients with MycN amplification.
Often promising preclinical results show weak in vivo efficacy due to drug testing on conventional two-dimensional (2D) monolayer cell cultures facing the challenge of accurately representing in vivo tumor biology, metabolic gradients and architecture. Aim of this study is to establish a three-dimensional (3D) cell culture model suitable to mimic a wide range of avascular tumor characteristics and include them into testing the RIST protocol to further improve preclinical studies. Therefore we used three oncogene MycN-amplified (MNA) (SK-N-BE(2), Kelly, IMR-32), two MycN-non amplified (MNN) (SK-N-AS, SK-N-SH) and one MycN-inducible (MNI) (Tet21N) NB cell lines. The 3D cell cultures were evaluated by determining the size, number, and viability of spheroids at various time points after seeding increasing cell numbers, applying distinct growth supplements, and providing different types of ultra-low attachment plates. Furthermore, the gene expression of various cancer stem cell (CSC) markers (CXCR4, BMI1, NANOG, ABCG2) was evaluated by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction (RTqPCR) comparing 2D and 3D cell cultures. To assess the RIST protocol on spheroid formation, drug treatment was started directly after cell plating, while spheroid growth was assessed on completely formed spheroids.
Our data demonstrate that the viability of all tested NB spheroids was significantly reduced applying the same half maximal inhibitory concentration (IC50) as applied in 2D cell cultures. In this study, we could verify previously published data of MycN-inducible NB cell line Tet21N demonstrating that expression of high MycN levels being more sensitive to mTOR inhibition by Rapamycin compared to cells expressing lower MycN levels. Further we validated CXCR4 as a CSC marker being higher expressed in all tested NB spheroids compared to 2D monolayer cultures. Interestingly, all tested CSC markers except ABCG2 showed a significant higher upregulation in expression in the MNN cell lines compared to MNA cell lines.
In conclusion, despite the presence of elevated CSC marker expression our data validated the efficacy of the RIST protocol in the in vitro 3D model of NB suggesting that the RIST therapy may also be effective in a more aggressive subset of tumors. Overall, the established 3D cell culture model is a valuable complement for preclinical testing of novel drugs against neuroblastoma even in high-throughput screening (HTS) formats.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Neuroblastom (NB) stellt einen der häufigsten malignen soliden Tumore im Kindesalter dar. Gerade Patient:innen mit rezidivierten und therapierefraktären NB (rNB) leiden unter einer schlechten Prognose. Für diese Patientengruppe wurde ein neues, multimodales Therapiekonzept entwickelt. Die RIST-Therapie kombiniert molekular wirksame Biologika (Rapamycin und Dasatinib) mit herkömmlichen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Neuroblastom (NB) stellt einen der häufigsten malignen soliden Tumore im Kindesalter dar. Gerade Patient:innen mit rezidivierten und therapierefraktären NB (rNB) leiden unter einer schlechten Prognose. Für diese Patientengruppe wurde ein neues, multimodales Therapiekonzept entwickelt. Die RIST-Therapie kombiniert molekular wirksame Biologika (Rapamycin und Dasatinib) mit herkömmlichen Zytostatika (Irinotecan und Temozolomid) in einem metronomischen Therapieschema. In einer prospektiven klinischen Phase-II-Studie (RIST-rNB-2011, NCT01467986), die das RIST-Protokoll an Patient:innen mit rezidivierten und therapierefraktären NB testete, konnte ein signifikant höheres Progressionsfreies Überleben sowie Gesamtüberleben bei Patient:innen mit amplifizierten MycN-Status gezeigt werden. Jedoch zeigen oft präklinisch vielversprechende neuartige Therapeutika in vivo eine deutlich verringerte bis keine Effektivität in der Tumor-Therapie. Dies ist auf das alleinige Testen neuer Behandlungsoptionen in konventionellen zweidimensionalen (2D)-Zellkulturmodellen zurückzuführen, wobei essenzielle Aspekte für das Ansprechen auf Therapeutika in vivo wie die Tumorbiologie, metabolische Gradienten und Tumorarchitektur vernachlässigt werden.
Ziel dieser Dissertation ist es daher ein dreidimensionales (3D)-Zellkulturmodell des NBs in Form von Sphäroiden zu etablieren, um Charakteristika von avaskulären soliden Tumoren in die Testung und Optimierung der RIST-Therapie in präklinischen Studien zu inkludieren. Hierfür wurden drei MycN-amplifizierte (MNA)-Zelllinien (SK-N-BE(2), IMR-32 und Kelly), zwei MycN-nicht amplifizierte (MNN)-Zelllinien (SK-N-SH und SK-N-AS) und eine MycN-induzierbare (MNI)-Zelllinie (Tet21N) verwendet. Diese wurden hinsichtlich ihrer Größe, Anzahl und Viabilität an unterschiedlichen Zeitpunkten, nach Zugabe verschiedener Medien-Zusätze und auf verschiedenen Ultra-Low Attachment Platten-Designs evaluiert. Zudem wurde mittels reverser Transkription und nachfolgender quantitativer Polymerase-Chain-Reaction (RTqPCR) die Expression von Krebsstammzellmarkern (CXCR4, BMI1, NANOG, ABCG2) gemessen. Mit den generierten Ergebnissen wurde im Anschluss das RIST-Protokoll am 3D-Modell getestet. Untersucht wurde einerseits die Auswirkung der Therapie auf die initiale Bildung der Sphäroide durch Behandlung der Zellen direkt nach der Aussaat, sowie die Auswirkung der Therapie auf das Sphäroid-Wachstum anhand bereits gebildeter Sphäroide.
Es konnte gezeigt werden, dass die Viabilität der Sphäroide aller getesteten NB-Zelllinien signifikant reduziert wurde bei Verwendung der gleichen mittleren inhibitorischen Konzentrationen (IC50) wie in der 2D-Zellkultur. Zudem konnten in dieser Arbeit zuvor veröffentliche Daten der MycN-induzierbaren NB-Zelllinie Tet21N bestätigt werden, die zeigen, dass Zellen mit einer hohen MycN-Expression empfindlicher auf die mTOR-Hemmung durch Rapamycin reagieren, verglichen mit Zellen mit einer niedrigeren MycN-Expression. Des Weiteren konnte CXCR4 in allen getesteten NB-Zelllinien als ein Krebsstammzellmarker mit einer höheren Expression in Sphäroiden im Vergleich zu der Expression in der 2D-Zellkultur validiert werden. Hervorheben lässt sich zudem, dass der Anstieg der Expression aller getesteten Krebsstammzellmarker, außer ABCG2, in den MNN-Zelllinien signifikant höher war als in den MNA-Zelllinien.
Zusammenfassend konnten in dieser Dissertation vielversprechende Ergebnisse für das RIST-Protokoll in einem in vitro 3D-Model des NB gezeigt werden. Trotz der erhöhten Expression von CSC-Markern konnte die Effektivität des RIST-Schemas im in vitro 3D-Modell des NB validiert werden, was darauf hindeutet, dass die RIST-Therapie auch in einer aggressiveren Tumor-Subpopulation wirksam sein könnte. Das etablierte 3D-Format des NB ist eine wertvolle Ergänzung für die präklinische Testung neuer Therapeutika in der NB Therapie und zur Durchführung von High-Throughput-Screening (HTS).
Metadaten zuletzt geändert: 15 Apr 2025 07:51
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