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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-768785
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.76878
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 17 Juni 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Matthias Mack und Prof. Dr. Barbara Schmidt |
| Tag der Prüfung: | 4 Juni 2025 |
| Institutionen: | Medizin > Abteilung für Nephrologie |
| Stichwörter / Keywords: | Covid-19 T-Zellhypoaktivität T-Zelldownstreameffekt Responderzellen Hemmender Faktor Plasma |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 76878 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel der Arbeit war die Messung des Aktivierungsgrads der Responderzellen im Rahmen der Covid-19 Erkrankung. Hierfür wurde die Ausprägung der jeweiligen spezifischen Oberflächenmarker der neutrophilen und basophilen Granulozyten und Monozyten durchflusszytometrisch bestimmt. Damit die Ursache der Hyporeagibilität untersucht werden konnte, wurde die FACS-Analyse sowohl in gewaschenem Blut als auch ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel der Arbeit war die Messung des Aktivierungsgrads der Responderzellen im Rahmen der Covid-19 Erkrankung. Hierfür wurde die Ausprägung der jeweiligen spezifischen Oberflächenmarker der neutrophilen und basophilen Granulozyten und Monozyten durchflusszytometrisch bestimmt. Damit die Ursache der Hyporeagibilität untersucht werden konnte, wurde die FACS-Analyse sowohl in gewaschenem Blut als auch in Vollblut durchgeführt. So konnten Rückschlüsse auf extrinsisch oder intrinsisch liegende hemmende Faktoren gezogen werden. Des Weiteren wurde mithilfe der Zugabe von IL-3 und GM-CSF die direkte Stimulierbarkeit der Responderzellen geprüft.
Zusätzlich wurden die absoluten Zellzahlen der neutrophilen und basophilen Granulozyten, Monozyten und plasmazytoiden dendritischen Zellen und die Ausprägung der Oberflächenproteine CD123 auf Monozyten und CD11b auf Neutrophilen im Rahmen der extrazellulären Färbung von frischem peripherem Blut detektiert.
Außerdem wurde die Expression der Zytokine IL-3, GM-CSF und IFN-ᵧ mittels ELISA gemessen, um damit Rückschlüsse auf mögliche Ursachen der Hyporeagibilität zu ziehen.
Materialien dieser Forschungsarbeit waren Vollblutproben von hospitalisierten Covid-19 Patientinnen und Patienten. Die Erkrankten wurden auf Normal- oder Intensivstation behandelt. Des Weiteren wurden Vollblutproben von gesunden Probandinnen und Probanden als Vergleichsbasis genutzt. Die Zelltypisierung und Rezeptordetektion erfolgte durchflusszytometrisch. Die Messung der jeweiligen Zytokinkonzentration erfolgte mittels ELISA. Für die extrazelluläre Färbung des frischen Blutes wurden die Proben für 20 Minuten mit einem Mix aus fluoreszierenden Antikörpern inkubiert und anschließend durchflusszytometrisch gemessen.
Für den Vollblut-Assay wurden aus jeder Patientenprobe jeweils fünf Vollblutansätze und drei Ansätze mit gewaschenem Blut hergestellt. Für die gewaschenen Ansätze wurde zunächst das Plasma entfernt und daraufhin zweimal mit Medium gewaschen. Diese wurden daraufhin mit Medium, immobilisiertem anti-CD3 und Medium und Medium mit IL-3 versetzt. Den Vollblutansätzen wurde Medium, immobilisiertes anti-CD3 und Medium, immobilisiertes anti-CD3 + Medium mit IL-2, Medium mit IL-3 und Medium mit GM-CSF zugegeben. Die Proben wurden daraufhin für 23,5 h bei 37º inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden jeweils die Überstände abpipettiert, welche die spätere Durchführung von ELISAs der Zytokine IL-3, GM-CSF und IFN-ᵧ ermöglichten. Um die Zellen mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, wurden die Proben mit fluoreszierenden, monoklonalen Antikörpern versetzt. Zur Schaffung optimaler Bedingungen für die FACS-Analyse wurden die Erythrozyten lysiert sowie Counting Beads hinzugegeben. Daraufhin konnte die durchflusszytometrische Messung durchgeführt werden. Die Messung der jeweiligen spezifischen Oberflächenmarker der Responderzellen gaben Rückschlüsse auf deren Aktivität in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des jeweiligen Probenansatzes. Mittels des T-Zell stimulierendem anti-CD3 wurde deren Reaktivität detektiert. So konnte der Einfluss des Plasmas auf die Reaktivität der Responderzellen untersucht werden. Die direkte Stimulierbarkeit der Responderzellen wurde durch Zugabe von IL-3 und GM-CSF geprüft.
Die extrazelluläre Färbung ergab erhöhte Zellzahlen der Monozyten und neutrophilen Granulozyten unter den an Covid-19 Erkrankten. Die Zellzahl der basophilen Granulozyten zeigte sich bei den beatmeten Verstorbenen signifikant vermindert. Die Zahl der plasmazytoiden dendritischen Zellen war bei allen Covid-19 Patientengruppen vermindert.
Die durchflusszytometrische Analyse ergab einen verminderten Aktivitätsstatus der Responderzellen infolge der Stimulation mittels anti-CD3, welcher in allen Subpopulationen in Vollblut deutlicher als in gewaschenem Blut war. Diese Ergebnisse sprechen für eine Hypoaktivität der T-Zellen, was eine verminderte Freisetzung von Zytokinen und daraufhin abgeschwächte Aktivierung der Responderzellen zufolge hat. Die Ursache der Hypoaktivität muss durch einen oder mehrere hemmende Faktoren im Plasma bedingt sein.
Die ELISAs zeigten erhöhte Konzentrationen der Zytokine bei den nicht-beatmeten Erkrankten – bei Verstorbenen war die Expression vermindert. Zudem war die Zytokinkonzentration aller Patientengruppen in Vollblut geringer als in gewaschenem Blut.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The aim of the study was to measure the degree of activation of responder cells in the context of COVID-19 disease. For this purpose, the expression of the respective specific surface markers of neutrophils, basophils and monocytes was determined by flow cytometry. To investigate the cause of the hyporesponsiveness, FACS analysis was performed in both washed blood and whole blood. This allowed ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The aim of the study was to measure the degree of activation of responder cells in the context of COVID-19 disease. For this purpose, the expression of the respective specific surface markers of neutrophils, basophils and monocytes was determined by flow cytometry. To investigate the cause of the hyporesponsiveness, FACS analysis was performed in both washed blood and whole blood. This allowed conclusions to be drawn about extrinsic or intrinsic inhibitory factors. Furthermore, the direct stimulability of responder cells was tested using the addition of IL-3 and GM-CSF.
In addition, the absolute cell counts of neutrophils and basophils, monocytes, and plasmacytoid dendritic cells, as well as the expression of the surface proteins CD123 on monocytes and CD11b on neutrophils, were detected using extracellular staining of fresh peripheral blood samples. Furthermore, the expression of the cytokines IL-3, GM-CSF and IFN-γ was measured using ELISA to draw conclusions about possible causes of hyporesponsiveness.
The materials used for this research were whole blood samples from hospitalized COVID-19 patients. Patients were treated in normal or intensive care units. Whole blood samples from healthy volunteers were also used as a basis for comparison. Detection of the cell type and the surface markers were performed by using flow cytometry. The respective cytokine concentrations were measured by using ELISA. For extracellular staining of fresh blood, the samples were incubated with a mix of fluorescent antibodies for 20 minutes and then measured by using flow cytometry.
For the whole blood assay, five whole blood samples and three samples with washed blood were prepared from each patient. For the washed preparations, the plasma was first removed and then washed twice with medium. These were then supplemented with medium, immobilized anti-CD3 and medium and medium with IL-3. Medium, immobilized anti-CD3 and medium, immobilized anti-CD3 + medium with IL-2, medium with IL-3 and medium with GM-CSF were added to the whole blood samples. The samples were then incubated for 23.5 h at 37°C. After the incubation time, the supernatants were pipetted off, which enabled the subsequent performance of ELISAs of the cytokines IL-3, GM-CSF and IFN-γ. To analyze the cells by using flow cytometry, the samples were supplemented with fluorescent monoclonal antibodies. To create optimal conditions for FACS analysis, the erythrocytes were lysed and counting beads were added. Flow cytometry was then performed. Measurement of the specific surface markers of the responder cells provided information about their activity depending on the composition of the sample. Their reactivity was detected by using T-cell stimulating anti-CD3. This allowed to investigate the influence of plasma on the reactivity of the responder cells. The direct stimulability of the responder cells was tested by adding IL-3 and GM-CSF.
Extracellular staining revealed increased monocyte and neutrophil counts among COVID-19 patients. Basophil counts were significantly reduced in deceased patients. Plasmacytoid dendritic cell counts were reduced in all investigated COVID-19 patient groups.
Flow cytometric analysis revealed reduced responder cell activity following anti-CD3 stimulation, which was more pronounced in all subpopulations in whole blood samples than in washed blood samples. These results indicate T-cell hypoactivity, resulting in reduced cytokine release and subsequently attenuated responder cell activation. The cause of the hypoactivity must be one or more inhibitory factors in the plasma.
ELISAs showed increased cytokine concentrations in non-ventilated patients; the expression was significantly reduced in deceased patients. Furthermore, cytokine concentrations in all patient groups were lower in whole blood samples than in washed blood samples.
Metadaten zuletzt geändert: 17 Jun 2025 07:39
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