Die chronische Nierenerkrankung (= CKD) ist ein globales Gesundheitsproblem mit steigender Inzidenz, hoher Morbidität und Mortalität, sowie wachsenden Kosten für das Gesundheitssystem (Alaini et al. 2017). Eine frühzeitige Diagnose, Prävention und Behandlung der CKD erlauben eine Reduktion der mit CKD assoziierten bekannten Morbidität und Mortalität (Benoit et al. 2020).
Unabhängig von der Ätiologie ist die CKD unter anderem durch zwei Leitsymptome gekennzeichnet: zum einen durch eine Abnahme der glomerulären Filtrationsrate (= GFR), zum anderen durch eine erhöhte Ausscheidung von Proteinen, darunter Albumin, im Urin (Levin und Stevens 2014). Aufgrund der Ungenauigkeit bzw. der Abhängigkeit der eGFR-Formeln von verschiedenen äußeren Einflüssen (Alaini et al. 2017), sowie der Rückresorption von Albumin bzw. Proteinen im proximalen Tubulus bis dessen Rückresorptionsfähigkeit erschöpft ist kann es zu einer falschen Einschätzung der Nierenfunktion kommen (Castrop und Schießl 2017). Dies führt zu der Annahme, dass die Applikation Nieren-schützender Maßnahmen häufig verzögert erfolgt. Diese zuvor erwähnten Beobachtungen unterstreichen, dass neue nicht-invasive diagnostische und prognostische Biomarker zur Abschätzung der Nierenfunktion benötigt werden.
In Vorarbeiten dieser Arbeitsgruppe, konnte gezeigt werden, dass eine Einschränkung der Integrität der GFB dazu führt, dass Podozyten Albumin aus dem subpodozyten Bereich endozytieren und anschließend in Vesikel verpackt in den Urin abgeben (Schießl et al. 2016). Nur ein Teil dieser Vesikel wird im proximalen Tubulus rückresorbiert, der Großteil der Albumin-beladenen podozytären Vesikel erscheint im Endharn (Castrop und Schießl 2017).
Basierend auf diesen Vorarbeiten wurde untersucht, welche Faktoren einen Einfluss auf die Höhe der vesikulären Albumin- und Podocalyxin-Konzentration haben. Des Weiteren wurde das Potential dieser beiden Proteine als prognostischer und diagnostischer Biomarker für die strukturelle und funktionelle Integrität der Niere untersucht.
Mittels Ultrazentrifugation wurden extrazelluläre Vesikel aus Spontan-Urin-Proben von Teilnehmern der AugUR-Studie isoliert (Stark et al. 2015). Bei diesen handelt es sich um ältere mobile Probanden aus Regensburg und Umgebung mit einem Mindestalter von 70 Jahren. Die Urin-Proben, sowie eine Vielzahl an klinischen Parametern wurden zu drei Zeitpunkten gesammelt bzw. bestimmt. Die Konzentration der vesikulären Variablen im Harn wurde mittels ELISA bestimmt und anschließend auf die Kreatinin-Konzentration im Urin normalisiert. Des Weiteren wurden die Vesikel mittels WesternBlot, Nanoparticle Tracking Analysis und Laser-Scanning-Mikroskopie charakterisiert.
Die Charakterisierungsversuche offenbarten, dass etwa 10 – 20% der aus dem Urin isolierten Vesikel podozytären Ursprungs waren. Die mittlere Größe der Vesikel bewegte sich, abhängig vom Zeitpunkt, zwischen 190 – 200 nm. Dabei geben die Analysen mit kleiner Probandenzahl Hinweise darauf, dass die eGFR bzw. Nierenfunktion einen Einfluss, auf die Größe der Vesikel hat.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Großteil der Varianz des vesikulären Albumins bzw. Podocalyxins durch die jeweils andere vesikuläre Variable, sowie der Albumin bzw. Protein-Konzentration im Urin erklärt werden kann. Des Weiteren bestanden geschlechtsspezifische Unterschiede in der Höhe der vesikulären Albumin-Konzentration. So war dieselbe nach Normalisierung auf Kreatinin zu allen drei Zeitpunkten bei männlichen Probanden signifikant niedriger als bei weiblichen. Die Ausscheidung von vesikulärem Albumin bzw. Podocalyxin unterlag einer Sättigungsdynamik.
In den durchgeführten Querschnittsanalysen mit den Proben/Messwerten der oben beschriebenen Kohorte konnten negative Assoziationen zwischen der eGFRCys und vesikulärem Albumin zu allen drei Zeitpunkten bzw. Podocalyxin zu F2 beobachtet werden. Hohe Konzentrationen an vesikulärem Albumin bzw. Podocalyxin sind demnach mit einer verminderten Nierenfunktion assoziiert. Darüber hinaus konnten positive Assoziationen zwischen den vesikulären Variablen und der uACR bzw. der A1M/Krea-Ratio zum jeweiligen Zeitpunkt beobachtet werden. Probanden in deren Urin hohe Konzentrationen an vesikulärem Albumin bzw. Podocalyxin nachgewiesen werden konnten, weisen ebenfalls hohe Konzentrationen an freiem Albumin bzw. α-1-Mikroglobulin im Harn auf. Der fehlende lineare Zusammenhang zwischen der jährlichen Änderung der eGFRCys und den vesikulären Variablen zeigte, dass die vesikulären Variablen keine Änderung derselben über die Zeit vorhersagen. Zwischen der jährlichen Änderung der uACR und den vesikulären Variablen bestand ein negativer Zusammenhang. D.h. hohe vACR- bzw. vPCR-Werte zu Baseline sind mit einer verminderten Zunahme der uACR über die Zeit assoziiert. Derselbe negative Zusammenhang manifestierte sich auch zwischen der jährlichen Änderung der A1M/Krea Ratio und vesikulärem Podocalyxin zum BL-Zeitpunkt.
Gemäß der erhobenen Daten sind vesikuläres Albumin und Podocalyxin neue Biomarker der Nierenfunktion, sowie der Integrität der Filtrationsbarriere und des proximalen Tubulus. Des Weiteren können vesikuläres Albumin und Podocalyxin die Entwicklung bzw. den Fortschritt der Albuminurie vorhersagen. Vesikuläres Podocalyxin konnte als prognostischer Biomarker für die Entwicklung des Funktionszustandes des proximalen Tubulus etabliert werden.

Chronic kidney disease (CKD) is a global health problem with increasing incidence, high morbidity and mortality, as well as growing costs for the healthcare system (Alaini et al. 2017). Early diagnosis, prevention and treatment of CKD allow a reduction in the known morbidity and mortality associated with CKD (Benoit et al. 2020).
Independent of the aetiology, CKD is characterized by two main symptoms: a decrease in the glomerular filtration rate (= GFR) and an increased excretion of proteins, including albumin, in the urine (Levin and Stevens 2014). Due to the inaccuracy or dependence of the eGFR formulas on various external influences (Alaini et al. 2017), as well as the reabsorption of albumin or proteins in the proximal tubule until the reabsorption capacity of the latter is exhausted, an incorrect assessment of renal function can occur (Castrop and Schießl 2017). This leads to the assumption that the application of renoprotective measures is often delayed. These aforementioned observations underline the need for new non-invasive diagnostic and prognostic biomarkers to assess renal function.
Preliminary work by this working group, has shown that a restriction of the integrity of the GFB leads to the endocytosis of albumin by podocytes from the subpodocyte space and the subsequent release of the same, packaged in vesicles, into the urine (Schießl et al. 2016). Only some of these vesicles are reabsorbed along the proximal tubule; the majority of the albumin-containing podocyte-derived vesicles appears in the final urine (Castrop and Schießl 2017).
Based on this preliminary work, the factors influencing the levels of vesicular albumin and podocalyxin concentration were investigated. Furthermore, the potential of these two proteins as prognostic and diagnostic biomarkers for the structural and functional integrity of the kidney was investigated.
Ultracentrifugation was employed to isolate extracellular vesicles from spontaneous urine samples from participants of the AugUR study (Stark et al. 2015). Older mobile subjects from Regensburg and the surrounding area with a minimum age of 70 years were recruited. Urine samples and a large number of clinical parameters were collected or determined at three timepoints. The concentration of the vesicular variables in the urine was determined by ELISA and subsequently normalized to the urinary creatinine concentration. Furthermore, the vesicles were characterized by WesternBlot, nanoparticle tracking analysis and laser scanning microscopy.
The characterization experiments revealed that about 10 - 20% of the vesicles isolated from the urine were podocyte-derived. The average size of the vesicles ranged between 190 - 200 nm, depending on the timepoint. The analyses with a small number of subjects indicate that the eGFR or renal function has an influence on the size of the vesicles.
This study showed that the majority of the variance in vesicular albumin or podocalyxin can be explained by the other vesicular variable, as well as the albumin or protein concentration in the urine. Furthermore, gender-specific differences in the level of vesicular albumin concentration became apparent. The same was significantly lower in male subjects compared to female subjects at all three timepoints, after normalization to creatinine. The excretion of vesicular albumin and podocalyxin was subject to saturation dynamics.
In the cross-sectional analyses performed with the samples/measured values of the cohort described above, negative associations were observed between eGFRCys and vesicular albumin at all three timepoints and podocalyxin at F2. Thus, high concentrations of vesicular albumin or podocalyxin are associated with reduced renal function. In addition, positive associations were observed between the vesicular variables and the uACR or the A1M/Krea ratio at the respective timepoint. Subjects with high detectable concentrations of vesicular albumin or podocalyxin in the urine also showed high concentrations of free albumin or α-1-microglobulin in the urine. The lack of a linear relationship between the annual change in eGFRCys and the vesicular variables showed that the vesicular variables do not predict a change of the same over time. A negative correlation between the annual change in uACR and the vesicular variables was observed. I.e. high vACR or vPCR values at baseline are associated with a reduced increase in uACR over time. The same negative correlation also manifested itself between the annual change in A1M/crea ratio and vesicular podocalyxin at the BL timepoint.
According to the collected data, vesicular albumin and podocalyxin are new biomarkers of renal function, as well as the integrity of the filtration barrier and the proximal tubule. Furthermore, vesicular albumin and podocalyxin can predict the development or progression of albuminuria. Vesicular podocalyxin could be established as a prognostic biomarker for the development of the functional state of the proximal tubule.