Der Hauptaspekt dieser Dissertation ist die Entwicklung und Weiterentwicklung von Hydrogel basierten, dünnschichtigen optischen Sensoren und Assay Plattformen für bioanalytische und klinische Detektion von Wasserstoffperoxid (H2O2). Unter diesem Gesichtspunkt betrachtet zunächst ein kritischer Review neue und wesentliche Entwicklungen und Methoden von optischen Sensoren für H2O2 seit 2018. Bemerkenswert ist hier vor allem die immer stärkere Integration von Smartphones für optische und insbesondere reflektometrische Anwendungen. Während es bei einfach verwendbaren Applikationen eine Vielzahl an neuen und innovativen Matrices, Sensormaterialen und Katalysatoren gibt, werden hier auch oft kommerziell erhältliche Matrices und etablierte und Farbstoffe wie 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) oder Amplex RedTM verwendet. Für semi-reversible und -kontinuierliche Messungen gibt es vornehmlich neue Anwendungen mit chemilumineszenter Fließinjektionsanalyse (FIA). Die aktuell am besten entwickelte Plattform für die (vollkommen) reversible und kontinuierliche Detektion von H2O2 basieren auf O2-Löschung der Phosphoreszenz von Platinporphyrinen. Eine vollkommen ideale optische Detektions- und Messmethode existiert jedoch nach wie vor nicht.
Da bei kommerziell erhältlichen Assays für die Quantifizierung von H2O2 oft mehrere und damit zeitaufwändige Vorbereitungs- und Verdünnungsschritte benötigt werden, wurde eine sofort nutzbare (RTU) Mikrotiterplatten (MTP) basierte Plattform für die sehr schnelle Detektion und Einfachmessung von H2O2 entwickelt. Grundlage der Plattform ist wie beim kommerziell erhältlichen Amplex RedTM Kit die katalytische und 1:1 stöchiometrische Umwandlung des nicht fluoreszenten und farblosen Stoffes 10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (ADHP) mit H2O2 zu dem fluoreszenten und pink gefärbten Resorufin in Gegenwart des Enzyms Meerrettich Peroxidase (HRP). Da HRP ADHP auch ohne H2O2 langsam in Resorufin umwandelt, müssen Enzym und Farbstoff voneinander getrennt aufbewahrt werden. Dafür wird ADHP als gefrorene Stammlösung in DMSO bei -20 °C und HRP in Lösung bei 4 °C gelagert. Um diese Problematik zu umgehen, wurde ADHP zunächst in die kommerziell erhältliche polyurethanbasierte Hydrogelmatrix D640 eingebettet. Das in EtOH/H2O gelöste D640 mit ADHP ließ sich dabei als µm dünne Schichten und Membranen mittels Streichbeschichtung auf ein klares Beschichtungssubstrat, hier industriell gefertigtes biaxial orientiertes PET auftragen, was den Herstellungsprozess sehr interessant für großtechnische Produktion macht. In diesen getrockneten Membranen war ADHP bei Raumtemperatur und damit um 42° C von der idealen Lagertemperatur von -20 °C entfernt für mindestens 22 Monate stabil. Im Assay wird durch die Zugabe von Lösung oder Probe der Farbstoff mit dem Aufschwellen des Hydrogels in die Lösung freigesetzt. Diese Membranen wurden mit einem Lasercutter ausgeschnitten und auf eine eigens, mit doppelseitigem Klebeband präparierte bodenlose Mikrotiterplatte geklebt. Um die Trennung von Enzym und Farbstoff zu erreichen, wurde konzentrierte HRP als Lösung in 30 nL großen Tröpfchen aufgetropft und damit eine Mischung von Enzym und Farbstoff minimiert. In einem Assay mit H2O2 in PBS pH 7.4 konnte mit diesen MTPs bei 37 °C innerhalb von nur drei Minuten Assayzeit H2O2 mit einem exzellenten unteren Detektionslimit (LOD) von nur 10 nmol·L 1 und einer oberen Grenze von bis zu 2 µmol·L-1 in 100 µL Probenvolumen detektiert werden. Der erreichte LOD war damit um eine Größenordnung besser als die Herstellerangabe des kommerziellen Kits (0.1 µmol·L-1 angegeben als 10 pmol pro 100 µL). Durch die Verwendung von 50 v% Glycerin als Kälteschutzmittel waren die RTU MTPs bei einer Lagerung bei -20 °C bis zu 13 Wochen ohne signifikanten Aktivitätsverlust und mit einer produktionsbedingten Varianz (cv) von ≈ 9 % verwendbar. Ohne oder mit dem falschen Kälteschutzmittel verursachte die Denaturierung der HRP innerhalb von 4 Wochen den vollständigen Verlust der Detektionskapazität. Glucose Oxidase (GOx) oder Lactat Oxidase (LOx) als H2O2-generierende Enzyme zusätzlich zu HRP mit auf die Platte aufgebracht, erlaubte die Detektion von Glucose, bzw. Lactat. Dabei war für Glucose einen LOD von 4 mmol·L 1 und nach oben hin bis zu 20 mmol·L-1 möglich und damit sehr interessant für die Detektion von milder und schwerer Hyperglykämie. Für Lactat wurde ein LOD von 0.04 mmol·L-1 erreicht und ein linearer Bereich von bis zu 0.4 mmol·L-1. Um herstellungsbedingte Schichtdickenunterschiede auszugleichen, wurde die Integration von Polystyrol Nanopartikeln (PSNP), beladen mit einem Cy5 Farbstoff, in die Membran untersucht. Die Einbettung des Farbstoffes in die Partikel war dabei zwingend notwendig, da der Referenzfarbstoff im Assay mit HRP und H2O2 ohne diesen Schutz auch abgebaut wurde. Die optimierte Beladung des Hydrogels mit Partikel ermöglichte damit eine ratiometrische Detektion.
Für die (Weiter)Entwicklung von Sensormembranen und die letztendlich angedachte kontinuierliche Detektion von H2O2 und in Kombination mit GOx und LOx, Glukose und Laktat, wurde Europium (III) Tetracyclin (EuTc) als lumineszente Sonde verwendet. Diese wurde in eine dafür entwickelte Sensormembran eingebettet. Die Membran besteht aus einer Sondenschicht aus D4, einem kommerziell erhältlichen Hydrogel auf Polyurethanbasis, das von einer Schutzschicht aus Polyvinylacetat/Celluloseacetat (PVAc/CA) bedeckt wird. Auch hier wurden die jeweiligen Membranen und Schichten auf ein klares Beschichtungssubstrat aus industriell gefertigtem, biaxial orientiertem PET mittels Streichbeschichtung aufgetragen. Die erwähnte Schutzschicht wurde dabei zur Vermeidung des störenden Einflusses von interferierenden Substanzen und für die Unterbindung ungewollter Freisetzung der Sonde benötigt. Diese Schutzschicht limitiert jedoch auch die Diffusion in die darunter liegende Hydrogelschicht und erhöht damit die Zeit, die das System zur initialen Equilibrierung benötigt, drastisch. Um diese Zeit zu verkürzen, wurde die Dicke der Schutzschicht reduziert. Auf der einen Seite wurde das durch die Verdünnung der Beschichtungslösung und auf der anderen Seite durch die mechanische Reduzierung der Streichbeschichtungshöhe erreicht. In beiden Fällen konnte eine signifikante Beschleunigung der initialen Equilibrierung erreicht werden. Um etwaige Schwankungen im Verlauf in der Messung auszugleichen und um in einem finalen Produkt die Kalibrierung zu vereinfachen, wurde auch hier eine ratiometrische Detektion entwickelt. 9,10-Bis(phenylethynyl)anthracene (BPEA) stellte sich dabei als idealer Referenzfarbstoff heraus, da er sowohl wie EuTc mit 405 nm angeregt werden konnte, jedoch einen deutlich kleineren Stokes-shift aufwies, und auch die Überlappung der Peaks der Emissionsspektren von Referenz und Sonde minimal waren. Durch die Einbettung des Referenzfarbstoffes in eine Schicht aus Cycloolefin-Copolymer (COC) konnte die Photostabilität mit einem Faktor von zwei im Vergleich zur Lösung deutlich erhöht werden. Als Alternative zu der Einbettung in eine separate Schicht konnte der Referenzfarbstoff auch in synthetisierte COC-Nanopartikel integriert werden. Da eine chemische und auch thermische Sterilisation des Sensors durch die eingebetteten Enzyme unmöglich war, wurden die separaten Sensorschichten mit γ-Bestrahlung behandelt. BPEA in seiner COC-Schicht und GOx in D4 zeigten dabei eine hervorragende Stabilität. Die Sensormembranen mit EuTc zeigten im Vergleich zur Referenz eine Reduktion der Lumineszenz von ≈ 50 %. Es ist davon auszugehen, dass optimierte temperierte Bedingungen und verkürzte Behandlungszeiten bei höherer Dosis diesen Verlust reduzieren. Die Sensormembranen zeigten keine oder nur minimale Beeinflussung in Gegenwart verschiedener Interferenzsubstanzen. Insbesondere konnten in der Literatur bekannte Interferenzen vermutlich durch die Schutzmembran abgewehrt werden. In verdünntem humanem Plasma zeigten die Sensormembranen eine gute Leistung. Durch die lange Lumineszenzlebenszeit von EuTc war die Detektion von H2O2 nicht nur in Lösung, sondern auch in der Membran möglich.

The main aspect of this dissertation is the development and advancement of hydrogel-based, thin-film optical sensors and assay platforms for bioanalytical and clinical detection of hydrogen peroxide (H2O2). From this point of view, a critical review first examines new and significant developments and methods of optical sensors for H2O2 since 2018. Of particular note here is the increasing integration of smartphones for optical and especially reflectometric applications. While there are a variety of new and innovative matrices, sensor materials and catalysts for easy-to-use applications, commercially available matrices and established dyes such as 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) or Amplex RedTM are also often used here. For semi-reversible and continuous measurements, there are mainly new applications with chemiluminescent flow injection analysis (FIA). The currently best developed platform for the (fully) reversible and continuous detection of H2O2 is based on O2-quenching of the phosphorescence of platinum porphyrins. The development of such systems is however, rare. Furthermore, a completely ideal optical detection and measurement method for H2O2 does still not exist to this day.
As commercially available assays for the quantification of H2O2 often require several and thus time-consuming preparation and dilution steps, a “ready to use” (RTU) microtiter plate (MTP)-based platform was developed for the highly sensitive, single-use detection of H2O2. Since commercially available assays for the quantification of H2O2 often require several and therefore time-consuming preparation and dilution steps, a “ready to use” (RTU) microtiter plate (MTP)-based platform was developed for the very rapid detection of H2O2. As with the commercially available Amplex RedTM kit, the platform is based on the catalytic and 1:1 stoichiometric conversion of the non-fluorescent and colorless substance 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (ADHP) with H2O2 to the fluorescent and pink-colored resorufin in the presence of the enzyme horseradish peroxidase (HRP). Since HRP slowly converts ADHP into resorufin even without H2O2, the enzyme and dye must be stored separately. For this purpose, ADHP is stored as a frozen stock in DMSO at -20 °C and HRP in solution at 4 °C. To avoid this problem, ADHP was first embedded in the commercially available polyurethane-based hydrogel matrix D640. The D640 with ADHP dissolved in EtOH/H2O could be applied as µm-thin layers and membranes on a clear coating substrate, in this case industrially manufactured biaxially oriented PET, by means of spread coating, which makes the manufacturing process very interesting for large-scale production. In these dried membranes, ADHP was stable for at least 22 months at room temperature, which is 42°C away from the ideal storage temperature of -20°C. In the assay, the addition of solution or sample releases the dye into the solution as the hydrogel swells. These membranes were cut out with a laser cutter and glued to a specially prepared bottomless microtiter plate with double-sided adhesive tape. To achieve separation of enzyme and dye, concentrated HRP was dripped as a solution in 30 nL droplets to minimize mixing of enzyme and dye. In an assay with H2O2 in PBS pH 7.4, H2O2 could be detected with these MTPs at 37 °C within only three minutes assay time with an excellent lower limit of detection (LOD) of only 10 nmol L-1, which is an order of magnitude better than the manufacturer's specification of the commercial kit (0.1 µmol·L-1 given as 10 pmol per 100 µL), and an upper limit of up to 2 µmol·L-1 in 100 µL sample volume. By using 50 v% glycerol as cryoprotectant, the RTU MTPs were usable for up to 13 weeks when stored at -20 °C without significant loss of activity and with a production-related variance (cv) of ≈ 9 %. Without or with the wrong cryoprotectant, denaturation of HRP caused complete loss of sensitivity and detection capacity within 4 weeks. Glucose oxidase (GOx) or lactate oxidase (LOx) as H2O2-generating enzymes applied to the plate in addition to HRP allowed the detection of glucose and lactate, respectively. For glucose, an LOD of 4 mmol·L-1 and up to 20 mmol·L-1 was possible, and thus very interesting for the detection of mild and severe hyperglycemia. For lactate, an LOD of 0.04 mmol·L-1 was achieved and a linear range of up to 0.4 mmol·L-1. In order to compensate for production-related differences in layer thickness, the integration of polystyrene nanoparticles (PSNP), loaded with a Cy5 dye into the membrane, was investigated. The embedding of the dye in the particles was necessary, as the reference dye was also degraded in the assay with HRP and H2O2 without this protection. The optimized loading of the hydrogel with particles thus enabled ratiometric detection.
For the (further) development of sensor membranes and the ultimately planned continuous detection of H2O2 and in combination with GOx and LOx, glucose and lactate, europium (III) tetracycline (EuTc) was used as a luminescent probe. This was embedded in a specially developed sensor membrane. The membrane consists of a probe layer of D4, a commercially available polyurethane-based hydrogel, which is covered by a protective layer of polyvinyl acetate/cellulose acetate (PVAc/CA). Here, too, the respective membranes and layers were applied to a clear coating substrate made of industrially produced, biaxially oriented PET by means of kinfecoating. The protective layer mentioned above was required to avoid the interfering influence of interfering substances and to prevent unwanted leakage of the probe. However, this protective layer also limits diffusion into the underlying hydrogel layer, drastically increasing the time the system needs for initial equilibration. To shorten this time, the thickness of the protective layer was reduced. On the one hand, this was achieved by diluting the coating solution and, on the other, by mechanically reducing the coating height. In both cases, a significant acceleration of the initial equilibration was achieved. In order to compensate for any fluctuations in the course of the measurement and to simplify calibration in a final product, ratiometric detection was also developed here. 9,10-Bis(phenylethynyl)anthracene (BPEA) proved to be the ideal reference dye, as it could be excited at 405 nm like EuTc, but had a significantly smaller Stokes shift, and the overlap of the peaks of the emission spectra of reference and probe was also minimal. By embedding the reference dye in a layer of cycloolefin copolymer (COC), the photostability was significantly increased by a factor of two compared to the solution. Alternatively, BPEA could also be integrated in synthesized COC-nanoparticles. Since chemical as well as thermal sterilization of the sensor was impossible due to the embedded enzymes, the separate sensor layers were treated with γ-irradiation. BPEA in its COC layer and GOx in D4 showed excellent stability. The sensor membranes with EuTc showed a reduction in luminescence of ≈ 50 % compared to the reference. It can be assumed that optimized temperature-controlled conditions and shorter treatment times at higher doses will reduce this loss. The sensor membranes showed no or only minimal influence in the presence of various interference substances. In particular, interferences known in literature could presumably be repelled by the protective membrane. The sensor membranes performed well in diluted human plasma. Due to the long luminescence lifetime of EuTc, the detection of H2O2 was possible not only in solution but also in the membrane.