The neurotensin receptor 1 (NTS1R), belonging to the class A G-protein coupled receptors (GPCRs), represents a potential target concerning pain treatment, antipsychotic therapy, and, due to its (over)expression in certain tumor types, cancer diagnosis and therapy. The tridecapeptide neurotensin (1.2) is the endogenous ligand of the preferably Gq/11-coupled NTS1R. Truncation studies demonstrated that the C-terminal hexapeptide NT(8-13) (1.3) represents the bioactive amino acid sequence of neurotensin. Therefore, NT(8-13) has been serving as a main lead compound in the development of peptidic NTS1R ligands.
Radiochemical and fluorescence-based binding assays are the most common methods to determine binding affinities of newly synthesized compounds. Since the comparison of binding constants obtained from different types of binding assays is difficult, the main project of this thesis was the development of dually labeled NTS1R ligands that bear a tritium and fluorescence label and, therefore, can be used in both kinds of assays. The reported bifunctional (SH, NH2) NTS1R ligand 2.5 (structure shown in Chapter 2) was considered a potential precursor since its conjugation to a fluorophore and a chelator led to an NTS1R ligand with subnanomolar binding affinity. However, the (re)synthesized diastereomeric octapeptides 2.5a and 2.5b, one of them corresponding to the reported compound 2.5, exhibited higher binding constants than reported (Ki values of 3.9 nM and 2.1 nM vs. an IC50 value of 0.43 nM). Moreover, the synthesis of the cyclic arginine derivative 2.8, incorporated in 2.5, was laborious. Therefore, compound 2.5 proved not to be the precursor of choice. Furthermore, the incorporation of the pyrrolidine-type β-amino acid 2.7 in NT(8-13) derivatives instead of Arg8 or Arg9 is presented in Chapter 2 (Collaboration with Prof. Reiser, Institute of Organic Chemistry, University of Regensburg). While the replacement of Arg8 gave an NTS1R binding affinity comparable to that of NT(8-13) (Ki = 0.12 nM), insertion of 2.7 in position 9 led to a marked decrease in binding affinity (Ki = 60 nM).
Pursuing a new strategy, different NT(6-13) analogs with two orthogonal functionalities (alkyne and amine group), allowing the attachment of a radio- and a fluorescence label, were synthesized (Chapter 3). Attachment of an azido-functionalized 5-TAMRA or Cy3B dye via the alkyne moiety and propionylation of the amine yielded five fluorescent NTS1R ligands, of which 3.13 and 3.18 were chosen for radiolabeling. The resulting tritium-labeled analogs [3H]3.13 and [3H]3.18, bearing a [3H]propionyl group instead of the ‘cold’ propionyl moiety, were characterized in radiochemical binding experiments, whereas their cold congeners 3.13 and 3.18 were studied in three different fluorescence-based assays (high-content imaging, flow cytometry, fluorescence anisotropy). While saturation and competition binding studies gave well comparable Kd and Ki values, kinetic studies revealed marked differences between the radiochemical and fluorescence-based assays, but also within the fluorescence-linked methods.
Another subproject of the thesis was the combination of three different reported achievements with respect to NTS1R binding affinity, proteolytic stability (in vitro and in vivo), and conjugation of NT(8-13) derivatives (Chapter 4). This led to peptide 4.17a which exhibits high NTS1R binding affinity with a Ki value in the picomolar range (Ki = 0.055 nM). Conjugation of 4.17a to a 5-TAMRA and sulfoCy5 fluorophore gave the fluorescent ligands 4.19 and 4.21 displaying similar NTS1R binding affinities (Ki = 0.14 nM (4.19); Ki = 0.094 nM (4.21)) and high in vitro proteolytic stabilities. Compounds 4.19 and 4.21 proved to be valuable molecular tools for flow cytometric NTS1R binding experiments and biomolecular imaging of NTS1R expression in cells and tumor tissue.
Furthermore, 4.17a was conjugated to three different chelators (DOTA (5.6), NOTA (5.7), (R)-NODA-GA (5.8)) followed by the incorporation of Ga3+ affording the potential PET ligands 5.9-5.11, which displayed high NTS1R binding affinities with subnanomolar Ki values of 0.13-0.31 nM and high in vitro stabilities in human plasma (Chapter 5). Insertion of the positron-emitting radionuclide 68Ga3+ in 5.6 yielded the NTS1R PET ligand [68Ga]5.9, which also showed high in vitro stability in human plasma.
Finally, inspired by high-affinity cyclic peptidic neuropeptide Y Y4 receptor ligands, two cyclic NT(8-13) derivatives (6.8, 6.9) were synthesized via an on-resin cyclization approach (Chapter 6). However, the cyclic peptides 6.8 and 6.9 exhibited, compared to NT(8-13), markedly decreased NTS1R binding affinities with Ki values of 112 nM and 11 nM, respectively.

Der G Protein-gekoppelte Neurotensin-Rezeptor 1 (NTS1R) stellt ein potenzielles Arzneistofftarget für die Schmerzbehandlung, die antipsychotische Therapie und, aufgrund seiner (Über-)Expression in bestimmten Tumorarten, die Krebsdiagnose und -therapie dar. Das Tridekapeptid Neurotensin (1.2) ist der endogene Ligand des vorzugsweise Gq/11-gekoppelten NTS1R. Sstudien haben gezeigt, dass das C-terminale Hexapeptid NT(8-13) (1.3) die bioaktive Aminosäuresequenz von Neurotensin repräsentiert. Daher dient NT(8-13) als wichtigste Leitverbindung bei der Entwicklung peptidischer NTS1R-Liganden.
Radiochemische und fluoreszenzbasierte Bindungsassays sind die gängigsten Methoden zur Bestimmung der Bindungsaffinitäten neu synthetisierter Verbindungen. Da der Vergleich von Bindungskonstanten aus verschiedenen Arten von Bindungsassays schwierig ist, war das Hauptprojekt dieser Arbeit die Entwicklung dual markierter NTS1R-Liganden, die eine Tritium- und eine Fluoreszenzmarkierung tragen und daher in beiden Arten von Assays verwendet werden können. Der beschriebene bifunktionelle (SH, NH2) NTS1R-Ligand 2.5 (Struktur in Kapitel 2 dargestellt) wurde als potenzieller Vorläufer angesehen, da seine Konjugation mit einem Fluorophor und einem Chelatbildner zu einem NTS1R-Liganden mit einer Bindungsaffinität im subnanomolaren Bereich führte. Die (neu) synthetisierten, diastereomeren Oktapeptide 2.5a und 2.5b, von denen eines der beschriebenen Verbindung 2.5 entspricht, wiesen jedoch höhere Bindungskonstanten als beschrieben auf (Ki-Werte von 3.9 und 2.1 nM vs. beschriebenen IC50-Wert von 0.43 nM). Darüber hinaus war die Synthese des zyklischen Arginin-Derivates 2.8, das in 2.5 enthalten ist, sehr aufwendig. Daher erwies sich 2.5 nicht als optimale Vorstufe. Darüber hinaus wird in Kapitel 2 (Zusammenarbeit mit Prof. Reiser, Institut für Organische Chemie, Universität Regensburg) die Inkorporation der pyrrolidinartigen β-Aminosäure 2.7 in NT(8-13)-Derivate vorgestellt. Während der Austausch von Arg8 eine mit NT(8-13) vergleichbare NTS1R-Affinität (Ki = 0.12 nM) ergab, führte der Einbau von 2.7 in Position 9 zu einer deutlichen Abnahme der Bindungsaffinität (Ki = 60 nM).
Im Rahmen einer neuen Strategie wurden verschiedene NT(6-13)-Analoga mit zwei orthogonalen Funktionalitäten (Alkin- und Aminogruppe) synthetisiert, was eine Radio- und Fluoreszenzmarkierung ermöglichte (Kapitel 3). Durch die Verknüpfung eines azido-funktionalisierten 5-TAMRA- oder Cy3B-Farbstoffs mit der Alkingruppe sowie der Propionylierung der Aminogruppe wurden fünf fluoreszierende NTS1R-Liganden erhalten, von denen 3.13 und 3.18 für die radioaktive Markierung ausgewählt wurden. Die resultierenden tritiummarkierten Analoga [3H]3.13 und [3H]3.18, die eine tritiierte [3H]Propionylgruppe trugen, wurden in radiochemischen Bindungsexperimenten charakterisiert, während ihre kalten Kongenere 3.13 und 3.18 in drei verschiedenen fluoreszenzbasierten Assays (High-Content Imaging, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzanisotropie) untersucht wurden. Während Sättigungs- und Kompetitionsbindungsstudien gut vergleichbare Kd- und Ki-Werte ergaben, zeigten kinetische Studien deutliche Unterschiede sowohl zwischen den radiochemischen und den fluoreszenzbasierten Assays als auch innerhalb der fluoreszenzbasierten Methoden.
Ein weiteres Teilprojekt der Arbeit war die Kombination dreier bereits berichteter Optimierungen hinsichtlich der NTS1R-Affinität, der proteolytischen Stabilität (in vitro und in vivo) und der Konjugation von NT(8-13)-Derivaten (Kapitel 4). Dies führte zu dem Peptid 4.17a, das eine hohe NTS1R-Affinität (Ki = 0.055 nM) aufwies. Die Konjugation von 4.17a mit einem 5-TAMRA- und sulfoCy5-Fluorophor ergab die Fluoreszenzliganden 4.19 und 4.21, die ähnliche NTS1R-Affinitäten (Ki = 0.14 nM (4.19); Ki = 0.094 nM (4.21)) und hohe proteolytische in vitro Stabilitäten zeigten. Die Verbindungen 4.19 und 4.21 erwiesen sich als wertvolle molekulare Werkzeuge für durchflusszytometrische NTS1R-Bindungsexperimente und die biomolekulare Bildgebung der NTS1R-Expression in Zellen und Tumorgewebe.
Darüber hinaus wurde 4.17a an drei verschiedene Chelatoren (DOTA (5.6), NOTA (5.7), (R)-NODA-GA (5.8)) konjugiert. Durch Insertion von Ga3+ wurden die potenziellen PET-Liganden 5.9-5.11 erhalten. Diese zeigten eine hohe NTS1R-Affinität mit subnanomolaren Ki-Werten von 0.13-0.31 nM und eine hohe in vitro Stabilität in menschlichem Plasma (Kapitel 5). Durch Einfügen des Positronen emittierenden Radionuklids 68Ga3+ in 5.6 entstand der NTS1R-PET-Ligand [68Ga]5.9, der ebenfalls eine hohe in vitro Stabilität in humanem Plasma aufwies.
Schließlich wurden, inspiriert durch hochaffine zyklische, peptidische Neuropeptid Y Y4-Rezeptorliganden, zwei zyklische NT(8-13)-Derivate (6.8, 6.9) mittels einer Zyklisierung am Harz synthetisiert (Kapitel 6). Die zyklischen Peptide 6.8 und 6.9 zeigten jedoch im Vergleich zu NT(8-13) eine deutlich verringerte NTS1R-Affinität mit Ki-Werten von 112 nM und 11 nM.