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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-781724
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.78172
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 8 Dezember 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Karsten Gülow und PD Dr. Dennis Harrer |
| Tag der Prüfung: | 2 Dezember 2025 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Innere Medizin I |
| Stichwörter / Keywords: | Kolorektales Karzinom, Methylierung, Hypermethylierung, DNA-Methylierung, Epigenetik, Reportersystem, Apoptose, Caspasen, Diagnostik, Früherkennung |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 78172 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Das kolorektale Karzinom (KRK) stellt eine der häufigsten malignen Erkrankungen dar und geht mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Zur Optimierung der Früherkennung und der Entwicklung innovativer zielgerichteter Therapiemöglichkeiten werden neue Biomarker zur sicheren molekularen Detektion des KRK benötigt. Epigenetische Merkmale wie die DNA-Methylierung bieten hierfür eine ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das kolorektale Karzinom (KRK) stellt eine der häufigsten malignen Erkrankungen dar und geht mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Zur Optimierung der Früherkennung und der Entwicklung innovativer zielgerichteter Therapiemöglichkeiten werden neue Biomarker zur sicheren molekularen Detektion des KRK benötigt. Epigenetische Merkmale wie die DNA-Methylierung bieten hierfür eine vielversprechende Option. Diese tritt bevorzugt in CpG-Inseln innerhalb von Promotorregionen auf und kann so zur verringerten Expression von Tumorsuppressorgenen führen.
Im Rahmen dieser Arbeit wird ein Reportersystem zur Identifikation malignen Kolongewebes anhand spezifischer Methylierungsmuster etabliert. Es besteht aus zwei Komponenten, die bei Bindung in räumlicher Nähe zueinander einen Komplex aus rekonstituierter splitTEV-Protease und Intein freisetzen. Das erste Konstrukt erkennt hierbei mithilfe der Methyl-Binding-Domain des MBD1-Proteins hypermethylierte CpG-Inseln. Das zweite Element bindet mit einer dCas9 spezifisch an die untersuchte Zielsequenz. Sind dementsprechend die CpG-Inseln nahe der dCas9-Bindungsstelle hypermethyliert, aktiviert die freigesetzte splitTEV-Protease das Lumineszenzprotein flipNluc, dessen emittierte Lumineszenz gemessen werden kann. Das Reportersystem in der ursprünglichen Form weist eine signifikante Signaldifferenz zwischen methylierten und unmethylierten Genen auf, die eigentliche Induktion der flipNluc erfolgt jedoch ineffizient. Indem die Position des kovalent gebundenen Inteins an der splitTEV-Protease geändert wird, kann diese Aktivierung der flipNluc deutlich verbessert werden. Die dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Position des split-Inteins an der splitTEV-Protease zu einer sterischen Hemmung führt und die Funktion des Enzyms somit beeinträchtigt wird.
Durch Whole Genome Sequencing werden zudem differenziell methylierte Regionen identifiziert, die für das Reportersystem eingesetzt werden und als hypermethylierte Biomarker des KRK dienen. Neben bereits bekannten Biomarkern identifizieren wir für das KRK erstmals die Gene DLX4, FOXC2, MNX1, PCDH7, PCDH8, RASAL3 und SIX1 als hypermethyliert. Die Gene DLX4, FOXC2, MNX1 und RASAL3 kodieren für Proteine, die größtenteils als Transkriptionsfaktoren an Zelldifferenzierung und Proliferation beteiligt sind. PCDH7 und PCDH8 kodieren für Proteine der Zell-Zell-Kontakte und werden ebenso wie SIX1 mit Metastasierung und Invasivität in Verbindung gebracht.
Das entwickelte Reportersystem zur Detektion hypermethylierter CpG-Inseln basiert auf der Aktivierung von Luciferasen durch proteolytische Spaltung. Dieses Prinzip wurde im zweiten Teil der Arbeit auf die Detektion der Caspase-Aktivität übertragen. Dadurch konnte eine Methode zur parallelen Aktivitätsbestimmung der drei Caspasen 3, 8 und 9 in lebenden Zellen und in Echtzeit etabliert werden, die eine gezielte Differenzierung apoptotischer Signalwege ermöglicht. Diese Caspasen werden während der Apoptose aktiviert, wobei eine Fehlregulation unter anderem bei malignen Erkrankungen auftritt. Das sogenannte Triple Caspase Assay verwendet drei induzierbare Reporterproteine, die jeweils eine Caspase anhand ihrer Erkennungssequenz registrieren: flip-mNG3A (Casp3), flipNluc (Casp8) sowie CPFluc (Casp9). Nach Validierung der Einzelreporter und erfolgreicher Durchführung eines Proof of Concept wurde das System durch lentivirale Transduktion stabil in HCT116 Zellen integriert. Diese Zelllinie bietet perspektivisch neue Möglichkeiten in der Entwicklung therapeutischer Wirkstoffe, indem sie Einblicke in die Aktivierung von Caspasen unter verschiedenen externen Bedingungen ermöglicht.
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit die Etablierung einer Methode zur Identifikation malignen Gewebes anhand hypermethylierter CpG-Inseln am Beispiel des KRK. Das Verfahren ist auf andere Krebsentitäten mit charakteristischen Methylierungsmustern übertragbar. Die Detektion maligner Zellen eröffnet zudem neue therapeutische Ansätze. Darüber hinaus werden bislang unbekannte hypermethylierte Biomarker für das KRK identifiziert und ein System zur parallelen Echtzeit-Messung der Caspase-Aktivität (Caspasen 3, 8 und 9) in lebenden Zellen vorgestellt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignant diseases and is associated with high morbidity and mortality. New biomarkers for reliable molecular detection of CRC are needed to optimize early diagnosis and develop innovative targeted therapies. Epigenetic features such as DNA methylation offer a promising option for this purpose. This occurs preferentially in CpG islands within ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignant diseases and is associated with high morbidity and mortality. New biomarkers for reliable molecular detection of CRC are needed to optimize early diagnosis and develop innovative targeted therapies. Epigenetic features such as DNA methylation offer a promising option for this purpose. This occurs preferentially in CpG islands within promoter regions and can lead to reduced expression of tumor suppressor genes.
In this work, a reporter system for identifying malignant colon tissue based on specific methylation patterns is established. It consists of two constructs that, when bound in close proximity to each other, release a complex of reconstituted splitTEV protease and intein. The first construct recognizes hypermethylated CpG islands using the methyl-binding domain of the MBD1 protein. The second element binds specifically to the target sequence using dCas9. If CpG islands near the dCas9 binding site are hypermethylated, the released splitTEV protease activates the luminescent protein flipNluc, which emits a measurable luminescence. The reporter system in its original form shows a significant signal difference between methylated and unmethylated genes, but the actual induction of flipNluc is inefficient. By changing the position of the covalently bound intein on the splitTEV protease, this activation of flipNluc can be significantly improved. The results indicate that the position of the split intein on the splitTEV protease leads to steric inhibition, thereby impairing the function of the enzyme.
Whole genome sequencing is used to identify differentially methylated regions that are used for the reporter system and serve as hypermethylated biomarkers for CRC. In addition to already known biomarkers, we have identified the genes DLX4, FOXC2, MNX1, PCDH7, PCDH8, RASAL3, and SIX1 as hypermethylated for CRC for the first time. The genes DLX4, FOXC2, MNX1, and RASAL3 encode proteins that are largely involved in cell differentiation and proliferation as transcription factors. PCDH7 and PCDH8 encode proteins involved in cell-cell contacts and, like SIX1, are associated with metastasis and invasiveness.
This reporter system for detecting hypermethylated CpG islands is based on the activation of luciferases through proteolytic cleavage. In the second part of the thesis, this principle was applied to the detection of caspase activity. This enabled the establishment of a method for the parallel real-time detection of caspase 3, 8, and 9 activity in living cells, which allows for the differentiation of apoptotic signaling pathways. These caspases are activated during apoptosis, with dysregulation occurring in malignant diseases, among other conditions. The so-called triple caspase assay uses three inducible reporter proteins, each of which registers a caspase based on its recognition sequence: flip-mNG3A (Casp3), flipNluc (Casp8), and CPFluc (Casp9). After validation of the individual reporters and successful completion of a proof of concept, the system was stably integrated into HCT116 cells via lentiviral transduction. This cell line offers new possibilities in the development of therapeutic agents by providing insights into the activation of caspases under various external conditions.
In summary, this thesis describes the establishment of a method for identifying malignant tissue based on hypermethylated CpG islands using CRC as an example. The method can be transferred to other cancer entities with characteristic methylation patterns. The detection of malignant cells also opens up new therapeutic approaches. In addition, previously unknown hypermethylated biomarkers for CRC are identified and a system for parallel real-time measurement of caspase activity (caspases 3, 8, and 9) in living cells is presented.
Metadaten zuletzt geändert: 08 Dez 2025 09:00
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