Transkription und posttranskriptionelle Regulation der EBER-Gene des Epstein-Barr-Virus während der Virusvermehrung

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-opus-432
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.9888

Greifenegger, Norbert

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Date of publication of this fulltext: 10 Oct 2001 10:46

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	9 October 2001
Referee:	Otto () Wolfbeis
Date of exam:	10 September 2001
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, formerly Prof. Wolfbeis)
Keywords:	Epstein-Barr-Virus , Posttranskriptionelle Regulation , Transkription , Lokalisation , EBER-Gene , FISH , EBV , EBER-genes
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	9888

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Abstract (German)

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Das Epstein-Barr-Virus gehört zur Familie der Gamma-Herpesviren und besitzt zwei Lebenszyklen: die Latenz und die Virusvermehrung. Die 164 und 172 Basen großen EBER-Transkripte werden von Polymerase III transkribiert und sind in fast allen latent infizierten Zellen nachzuweisen. In Vorarbeiten wurde gezeigt, dass EBER-1 beim Übergang in die Virusvermehrung abgeschaltet, EBER-2 hingegen weiter transkribiert wird.
Polymerase II-spezifische Transkriptionsfaktoren sind essentiell für die Transkription der EBER-Gene. Mittels Footprint- und EMSA-Versuchen wurden Faktoren gesucht, die für die unterschiedliche Regulation verantwortlich sein können. Dabei wurde eine funktionelle Bindungsstelle für den Faktor NFW identifiziert, die die Transkription von EBER-2 während der Replikation aufrecht erhalten könnte.
Obwohl während der Latenz und der Virusvermehrung die Transkription der EBERs unterschiedlich war, waren die Mengen an Transkripten in beiden Phasen gleich. Dies warf die Frage nach einer möglichen posttranskriptionellen Regulation der EBERs auf. Northern Blot-Experimente zeigten eine veränderte elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit während der lytischen Vermehrung. Eine Untersuchung der 5´-Enden mit Primer Extension- und der 3´-Enden mit RNase-Protection-Experimenten und 3´-RACE zeigten aber keine Veränderungen. Das unterschiedliche Laufverhalten wurde daher auf kovalente Modifikationen zurückgeführt.
Die Lokalisation der EBER-Transkripte wurde durch FISH untersucht. In latent infizierten, EBV-positiven Zellen waren die EBERs im Kern lokalisiert. Während der Virusvermehrung sowie in EBV-negativen Zellen waren sie im Zytoplasma. EBNA-1 und LMP-2A sowie die Gabe von Leptomycin B, das den crm1-vermittelten Kernexport hemmte, stellte die Kernlokalisation teilweise wieder her. Es wurde daher geschlossen, dass der Transport der EBERs aus dem Zellkern auf einem aktiven Transport beruht, der durch die Aktivität viraler Proteine während der Latenz gehemmt wird.

Translation of the abstract (English)

The Epstein-Barr virus, which is a member of the gamma-herpes viruses, has two life-cycles: latency and lytic replication. The EBER-transcripts, which are 164 and 172 nucleotides long, are transcribed by polymerase III and can be detected in almost all latently infected cells. Previously, it was shown that EBER-1 is down regulated during the lytic cycle. In contrast, EBER-2 is further transcribed. Polymerase II-specific transcription-factors are essential for the transcription of the EBER-genes. In order to identify factors responsible for this differential regulation the EBER-promoters were analysed with footprint- and EMSA-assays. In the promoter of EBER-2, a functional binding site for the factor NFW was detected, which was supposed to enable transcription of EBER-2 during replication.
Although the transcription of the EBER-genes was different during latency and lytic replication, the amount of transcripts was almost equal. This posed the question whether the function of the EBERs may be regulated by post-transcriptional mechanisms. Northern blot assays indicated a change in electrophoretic mobility of the EBER-transcripts during lytic replication. Analysis of the 5´-ends with primer extension-assays and of the 3´-ends with RNase protection and 3´-RACE revealed no extensions or degradations. Therefore, the different mobility was attributed to covalent modifications.
Sub-cellular localization, which may regulate the function of the EBER-transcripts, was examined by FISH. In EBV-positive cells, the EBERs were nuclear during latency. In contrast, during lytic replication as well as in EBV-negative cells, the EBERs were cytoplasmic. In EBV-negative cells EBNA-1 and LMP-2A as well as treatment with leptomycin B, which blocks crm1-mediated nuclear export, partially restored the nuclear localization. Therefore, the transport of the EBERs into the cytoplasm seemed to be an active process, which was blocked by viral protein during latency.

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