Die artifizielle Kontrolle von Enyzmen durch Licht ist ein sich schnell entwickelndes Teilgebiet des Proteindesigns und der synthetischen Biologie. Während die Regulation monomerer Enzyme über den Einbau photo-empfindlicher Elemente am aktiven Zentrum relativ unkompliziert ist und schon mehrmals durchgeführt wurde, stellt ist die Lichtregulation von allosterischen Signalen in Multienzym-Komplexen eine wesentlich größere Herausforderung dar. In der abgelaufenen Förderperiode haben wir dieses Ziel erreicht, indem wir allosterische Wechselwirkungen in den beiden Bienzym-Komplexen Imidazolglycerinphosphat Synthase (ImGPS) und Tryptophan Synthase (TS) effizient unter die Kontrolle von Licht stellen konnten. Zu diesem Zweck haben wir unnatürliche Aminosäuren verwendet, insbesondere die reversibel licht-schaltbare unnatürliche Aminosäure (lsUAA) Phenylalanin-4‘-Azobenzen (AzoF). Aufbauend auf diesen modellhaften Untersuchungen, wollen wir nun unsere Studien auf die nächste Komplexitätsstufe bringen und dabei sowohl die Vielseitigkeit als auch die Effizienz der Regulation von Allosterie durch Licht erhöhen.Zur Erhöhung der Vielseitigkeit, wollen wir neue lsUAAS implementieren, die auf anderen reversibel schaltbaren Chromophoren als AzoF basieren. Dazu werden wir drei lsUAAS synthetisieren, die Arylazopyrazol, Hemothioindigo und Fulgimide enthalten. Jeder dieser Chromophore weist vorteilhafte photochemische Eigenschaften auf, die komplementär zu AzoF sind. Im nächsten Schritt möchten wir Aminoacyl-tRNS Synthetasen mit hoher Affinität zu diesen lsUAAs evolvieren, wodurch deren Einbau während der heterologen Genexpression erleichtert wird. Schließlich werden wir das Potential dieser neuen lsUAAs für die Lichtregulation von Allosterie in unseren Modellenzymen ImGPS und TS testen. Dabei sind wir insbesondere daran interessiert, ob diese lsUAAs höhere Lichtregulationsfaktoren aufweisen als AzoF und die Enzyme an Postionen regulieren können an denen AzoF keinen Effekt zeigt.Zur Erhöhung der Effizienz, möchten wir die Proteinumgebung von photo-empfindlichen UAAs mittels gelenkter Evolution optimieren. Dabei planen wir die Ausweitung der Lichtregulation von zwei ImGPS Komplexen mit AzoF an distinkten Positionen, die nur eine moderate Lichtschaltbarkeit von Aktivität und Allosterie zeigten. Zu diesem Zweck werden wir semi-rationale Designprojekte durchführen und dabei auf Positionen in der Nachbarschaft von AzoF abzielen. Mit Hilfe eines licht-abhängigen Aktivitätsscreens hoffen wir Varianten zu finden, deren Lichtregulationsfaktor um mindestens eine Größenordung erhöht ist.Die Ergebnisse dieses Projekts werden Wege eröffnen, um neue photo-kontrollierbare allosterische Enzyme mit bisher unerreichten Eigenschaften zu erzeugen.
