| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (1MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-205890
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.20589
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 19 Januar 2012 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Roland Seifert |
| Tag der Prüfung: | 21 April 2011 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmakologie und Toxikologie (Prof. Schlossmann, ehemals Prof. Seifert) |
| Stichwörter / Keywords: | Allogene Knochenmarktransplantation, Spender-gegen-Wirt-Reaktion, B-Zell-Rekonstitution, CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, Immunregulation, allogeneic bone marrow transplantation, graft-versus-host-disease, B cell reconstitution, CD4+CD25+ regulatory T cells, immune regulation |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 20589 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die allogene Stammzelltransplantation ist ein etabliertes Verfahren zur Behandlung von malignen und einigen nicht-malignen Erkrankungen der Hämatopoese. Zur Minimierung immunologischer Komplikationen wird in der Regel zwischen HLA (Human leucocyte antigen)-identischen Spendern und Empfängern transplantiert, da mit steigender HLA-Disparität das Risiko für das Auftreten einer ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die allogene Stammzelltransplantation ist ein etabliertes Verfahren zur Behandlung von malignen und einigen nicht-malignen Erkrankungen der Hämatopoese. Zur Minimierung immunologischer Komplikationen wird in der Regel zwischen HLA (Human leucocyte antigen)-identischen Spendern und Empfängern transplantiert, da mit steigender HLA-Disparität das Risiko für das Auftreten einer Spender-gegen-Empfängerreaktion (graft-versus-host disease, GVHD) steigt. Trotzdem kommt es auch nach HLA-identischer Transplantation häufig zur GVHD, die in dieser Konstellation durch Minor-Histokompatibilitätsantigene ausgelöst wird. Klinisch wird nach allogener Stammzelltransplantation eine verzögerte Rekonstitution des adaptiven Immunsystems beobachtet, wofür hauptsächlich die zur GVHD-Prophylaxe eingesetzte Immunsuppression verantwortlich gemacht wird. Diese prolongierte Immundefizienz erhöht das Risiko für opportunistische Infektionen, die oftmals zum Tod der Patienten führen. Zentrales Ziel der aktuellen Transplantationsforschung ist es deshalb, Strategien zu identifizieren, die zur Verbesserung der Immunrekonstitution führen ohne das Risiko für die Auslösung einer GVHD zu erhöhen.
Die dieser Arbeit zugrundeliegende Hypothese war, dass nicht nur die pharmakologische Immunsuppression zur verzögerten Immunrekonstitution beiträgt, sondern insbesondere die schwere GVH-Reaktion. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurde ein MHC (Major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex) -differentes Mausmodell ohne pharmakologische Immunsuppression eingesetzt und die B-Zell-Rekonstitution nach allogener KMT (Knochenmarktransplantation) in Tieren mit und ohne GVHD untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass es in Tieren mit schwerer GVHD (nach Transplantation von Knochenmark (KM) und T-Zellen) zu keiner Rekonstitution des B-Zell-Kompartiments kam, während Tiere ohne GVHD (Transplantation von KM ohne T-Zellen) eine rasche und vollständige Rekonstitution der Spender-B-Zellen zeigten. Histologisch und mittels durchflusszytometrischer Messmethode wurde nachgewiesen, dass die GVHD zur Zerstörung peripherer Lymphorgane führte. Diese schien aber nicht alleine für die B-Zell-Defizienz verantwortlich zu sein, da sich in Knochenmarkanalysen herausstellte, dass die B-Zell-Rekonstitution bei GVHD bereits auf der Stufe von B-Vorläuferzellen im KM gestört war. Darüber hinaus zeigte sich auch ein Einfluss auf Vorläuferzellen der T-Zell-Reihe, so dass zu vermuten war, dass vor allem gemeinsame Vorläuferzellen (common lymphoid precursor, CLP) beeinträchtigt wurden, während die Myelopoese nur unwesentlich betroffen war. Diese Störungen in der B- und T-Zell-Entwicklung in GVHD-Tieren konnte bereits zu sehr frühen Zeitpunkten (innerhalb von 7 Tagen) nach Transplantation detektiert werden. Um zu beweisen, dass inflammatorische Prozesse im Rahmen der GVHD die B-Lymphopoese inhibierten und nicht lediglich das Anwachsen von Vorläuferzellen beeinträchtigt wurde, wurde die Erkrankung in separaten Experimenten erst nach Rekonstitution der Spenderlymphopoese an Tag 21 nach KMT durch die nachträgliche Infusion von Spender-T-Zellen induziert. Auch in diesem Modell kam es dosisabhängig zu einer Suppression der B-Zellen, so dass bestätigt wurde, dass GVHD-induzierende T-Zellen zu inflammatorischen Reaktionen führten, die selbst bereits rekonstituierte B-Zellen (HLA-identisch zu den GVHD-induzierenden T-Zellen) eliminierten.
In früheren Publikationen der Arbeitsgruppe wurde nachgewiesen, dass der adoptive Transfer von CD4+CD25+FoxP3+ (Forkhead box P3, Transkriptionsfaktor) natürlichen regulatorischen T-Zellen (Treg Zellen) des Spenders im Mausmodell vor akuter GVHD schützt. Deshalb wurde zusätzlich untersucht, wie sich der Transfer dieser immunsuppressiven T-Zell-Population auf die B-Zell-Rekonstitution auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass diese Art der immunologischen Immunsuppression nicht zur Paralyse des Immunsystems führte, sondern dass die GVHD-induzierte Zerstörung der Lymphorgane verhindert und die Rekonstitution der lymphatischen Vorläuferzellen im Knochenmark gefördert wurde. In der Summe ergab sich hierdurch nicht eine schlechtere, sondern im Gegenteil, eine verbesserte Immunrekonstitution nach allogener KMT.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, die Mechanismen der gestörten Immunrekonstitution bei GVHD aufzuklären. Aus publizierten Arbeiten war bekannt, dass die Zytokine IFN-gamma (Interferon-gamma) und TNF (Tumor necrosis factor, Tumornekrosefaktor) die B-Lymphopoese beeinträchtigen können und dass diese Zytokine bei akuter GVHD vermehrt sezerniert werden. Es wurde deshalb untersucht, ob sie bei GVHD direkt auf lymphatische Vorläuferzellen im KM einwirken. Hierfür wurde KM von Wildtyptieren und von IFN-gamma- bzw. TNF-Rezeptor-defizienten Spendern ko-transplantiert und anschließend untersucht, ob die B-Lymphopoese in GVHD-Tieren selektiv aus dem Rezeptor-defizienten Mark regeneriert. Eine selektive Regeneration der B-Zellen wurde jedoch weder aus IFN-gamma- noch aus TNF-Rezeptor-defizientem KM beobachtet, so dass keines dieser Zytokine alleine für die B-Zell-Defizienz bei GVHD verantwortlich zu sein schien.
Da Zytokine nicht nur direkt auf die Vorläuferzellen im KM wirken könnten sondern auch indirekt über die Zerstörung der B-Zell-Nische (bzw. CLP-Nische), wurden anschließend Retransplantationsstudien durchgeführt. Hierfür wurde KM aus Tieren mit GVHD isoliert, T-Zell-depletiert und erneut in letal bestrahlte Empfänger transplantiert. Es zeigte sich in diesen Tieren, dass Stammzellen aus GVHD-Tieren in GVHD-freien Empfängern der 2. Generation die B-Lymphopoese prinzipiell rekonstituieren konnten. Die leicht verzögerte Immunrekonstitution in diesen Empfängern im Vergleich zu Empfängern von KM aus unbehandelten Spendern wies darauf hin, dass das KM von GVHD-Tieren geringere Mengen an determinierten Vorläuferzellen enthielt. Durch Verwendung von Stromazellkulturen, die eine Entwicklung von B-Zell-Kolonien unterstützen, konnte die Defizienz von CLP im Knochenmark von Tieren mit GVHD in vitro bestätigt werden.
Auf diesen Ergebnissen aufbauend sollen in zukünftigen Experimenten mittels Vielfarben-Durchflusszytometrie die derzeit bekannten Stadien der lymphatischen Vorläuferzellen im KM von GVHD-Tieren exakt quantifiziert werden, um die Stufe des Entwicklungsblocks genau zu definieren. Da auch ein Defekt in der T-Zell-Rekonstitution von GVHD Tieren gezeigt werden konnte, wird erwartet, dass primär die CLP betroffen sind. Darüber hinaus sollte in Folgeversuchen untersucht werden, wie ko-transplantierte Spender-Treg-Zellen die frühe Rekonstitution der lymphatischen Vorläufer im KM fördern. Vor allem sollte aber untersucht werden, ob die Graft-versus-Leukämiewirkung bei B-Zell-Malignomen nicht zumindest teilweise auf solche B-Zell-toxischen Wirkungen der GVHD-induzierten Inflammation zurückzuführen ist, da bisher angenommen wird, dass Transplantat-gegen-Leukämie-Effekte (Graft-versus-leukemia, GVL) ausschließlich auf der Erkennung von Alloantigenen durch Spender-T-Zellen auf hämatopoetischen Empfängerzellen beruhen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (SCT) is a well-established treatment option for patients with malignant and some non-malignant hematologic diseases. To minimize the risk for immunological complications, transplantation between HLA-identical donor and recipient pairs is generally preferred, since HLA disparity is a major risk factor for the development of graft-versus-host ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (SCT) is a well-established treatment option for patients with malignant and some non-malignant hematologic diseases. To minimize the risk for immunological complications, transplantation between HLA-identical donor and recipient pairs is generally preferred, since HLA disparity is a major risk factor for the development of graft-versus-host disease (GVHD). Yet, due to differences in minor histocompatibility antigens, GVHD even occurs after HLA identical transplantation. For the prevention of severe GVHD immunosuppressive medication is usually administered and the delayed reconstitution of the adaptive immune system is typically attributed to this pharmacologic immunosuppression. Yet, prolonged immunodeficiency increases the risk for opportunistic infections, which are main causes of morbidity and mortality after SCT. A central goal in current transplantation research is the improvement of immune reconstitution whithout increasing the risk for the development of GVHD.
The hypothesis to be examined in this thesis was that pharmacological immunosuppression may not be the sole reason for the delayed immune reconstitution after allogeneic SCT, but that severe GVHD impairs the recovery of the adaptive immune system. Using a murine model in which bone marrow (BM) and peripheral T cells were transplanted across complete major histocompatibility complex (MHC) barriers in the absence of pharmacologic immunosuppression, the influence of GVHD on B cell reconstitution was examined. We found that animals with severe GVHD (after transplantation of BM and T cells) showed no reconstitution of their B cell compartment, whereas animals without GVHD (transplantation of BM only) rapidly reconstituted their B cell compartment after transplantation. Histological tissue examinations and flow cytometric analyses of lymphocytes from GVHD animals revealed that the B cell deficiency was not only caused by the GVHD-induced destruction of secondary lymphoid organs, but also by a lack of B cell precursors in the BM. In addition, diminished numbers of T cell precursors were observed in the BM of animals with GVHD, suggesting that mainly common lymphoid progenitors (CLP) were affected, whereas myelopoiesis was hardly involved. These defects in B and T cell development in animals with GVHD were detectable as early as 7 days after BMT. To prove that inflammatory processes in GVHD impaired B lymphopoiesis and to exclude that GVHD solely inhibited early CLP-engraftment, GVHD was induced in recipients of MHC-disparate BM that had already reconstituted their B cell compartment 21 days after BMT. Even in this model, B cells disappeared from the periphery as soon as GVHD was induced, suggesting that inflammation rather than direct cytotoxic alloresponses are responsible for the elimination of B cells, as the GVHD-inducing donor T cells were syngeneic to the initial BM graft in this case.
Previous publications from our group showed that co-transplantation of freshly isolated donor-derived natural CD4+CD25+ regulatory T cells (Treg) prevents lethal GVHD after allogeneic BMT in murine models. To determine whether their suppressive effect enhances or inhibits immune reconstitution after allogeneic BMT we examined the recovery rate of the peripheral B cell compartment after co-transplantation of BM, conventional and regulatory T cells. The immunosuppressive effect of Treg cells did not paralyse the immune system, but prevented GVHD-induced lymphoid tissue destruction and therefore even promoted the reconstitution of B- and T lymphocytes in spleen and BM. Taken together, these experiments showed that donor Treg cells protect from GVHD and thereby foster rather than hamper immune recovery after allogeneic BMT.
In the second part of the thesis we tried to identify mechanisms that contribute to the impaired immune reconstitution in acute GVHD. It was previously shown that interferon-gamma (IFN-gamma) and tumor necrosis factor (TNF) impair B lymphopoiesis and that elevated levels of these cytokines are secreted during the course of GVHD. To examine their influence on lymphoid progenitor cells, BM from wildtype (wt) and IFN-gamma- or TNF-receptor-deficient mice was co-transplanted to determine whether B lymphopoiesis reconstituted selectively from the receptor-deficient progenitors. Yet, a preferential B cell reconstitution in animals with GVHD was neither observed in recipients of IFN-gamma- nor TNF-receptor-deficient BM. Thus none of these cytokines seems to impair B cell reconstitution during GVHD on its own.
Pro-inflammatory cytokines secreted during GVHD may not only impair B lymphopoiesis directly by affecting B cell precursors, but also indirectly, e.g. through the destruction of the B cell niche in the BM microenvironment. To address this issue, re-transplantation experiments were performed in which BM from animals with GVHD was isolated, T cell-depleted and transplanted into irradiated secondary recipients. Stem cells isolated from animals with GVHD were still capable of reconstituting B lymphopoiesis in secondary recipients (in the absence of GVHD). Nevertheless, a delayed and slightly reduced immune reconstitution was observed in these recipients (as compared to mice that received BM from non-GVHD donors), again indicating that BM from mice with GVHD contain fewer determinated progenitor cells. The lack of precursors in the bone marrow of animals suffering from GVHD was confirmed in in vitro experiments, as BM cells from GVHD mice did not give rise to B cell colonies in appropriate stroma cell culture assays.
Based on these results, detailed phenotypic and quantitative analyses of all lymphoid progenitor cells in the bone marrow of GVHD animals will be performed in future experiments. These flow cytometric analyses will exactly identify the developmental stage in which B lymphopoiesis is blocked in GVHD. Since T cell reconstitution is also affected, we expect the blockade at the level of CLPs. Once the targets within the lymphoid precursor population are identified, further experiments will be performed to elucidate how donor Treg cells promote the reconstitution of early lymphoid progenitors after transplantation.
Thus far, graft-versus-leukemia effects are believed to be exclusively based on the recognition of host hematopoietic alloantigens by donor T cells. Yet, it will be exciting to see in future experiments, whether the here discovered toxic effects on B cells by GVHD-induced inflammation might at least partially contribute to the graft-versus-leukemia/lymphoma effect in B cell lymphomas and leukemias after allogeneic BMT.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 06:55
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik