Genetische Transformation von Volvox carteri mit einem dominant-selektiven Resistenzmarker

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	7 January 2004
Referee:	Rüdiger (Prof. Dr.) Schmitt
Date of exam:	22 December 2003
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie
Keywords:	Transformation <Genetik> , Volvox , Grünalgen , Heterologe Genexpression , Dominanter Resistenz-Marker , transformation , genetics , Volvox , green algae , heterologous marker , resistance
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10155

Abstract (German)

Das Aminoglykosid-Antibiotikum Paromomycin, welches hoch toxisch für die Grünalge Volvox carteri ist, wird durch die Aminoglykosid-3'-Phosphotransferase (APHVIII) aus Streptomyces rimosus effektiv inaktiviert. In dieser Arbeit wurde das bakterielle aphH Gen, das dieses Enzym kodiert genetisch für die Expression in Volvox bearbeitet, um dieser Alge eine Paromomycin Resistenz zu vermitteln. Die ...

Abstract (German)

Das Aminoglykosid-Antibiotikum Paromomycin, welches hoch toxisch für die Grünalge Volvox carteri ist, wird durch die Aminoglykosid-3'-Phosphotransferase (APHVIII) aus Streptomyces rimosus effektiv inaktiviert. In dieser Arbeit wurde das bakterielle aphH Gen, das dieses Enzym kodiert genetisch für die Expression in Volvox bearbeitet, um dieser Alge eine Paromomycin Resistenz zu vermitteln. Die maximale Resistenz wurde dabei durch ein chimäres aphH Gen unter konstitutiver Kontrolle eines hsp70A-rbcS3 (Hitzeschock-Rubisco S3) Promotors in Kombination mit der 3'-NTR des Volvox Rubisco S3 Gens erzielt. Dieses aphH-enthaltende Konstrukt schien als dominanter Selektionsmarker für die genetische Transformation von Volvox carteri mit Transformationsraten von bis zu 9 Transformanten pro 10.000 Zellen am besten geeignet zu sein. Die Kotransformationseffizienzen mit einem nicht-selektionierbaren Marker liegen bei über 30 %. Das chimäre aphH Gen wurde stabil, oft auch als Tandem Wiederholung, in das Volvox Genom integriert. Eine für die Paromomycin-Resistenz ausreichende Expression konnte mit diesem Plasmid erreicht werden. Aus diesem Grund ist das bakterielle aphH Gen ein idealer dominant selektionierbarer Marker für die Transformation und Kotransformation von Wildtyp- und Mutanten-Stämmen von V. carteri mit maximalen Raten.

Translation of the abstract (English)

The amino-glycoside antibiotic paromomycin that is highly toxic to the green alga Volvox carteri is efficiently inactivated by aminoglycoside-3'-phosphotransferase from Streptomyces rimosus. In an attempt to develop a new dominant selectable marker � paromomycin resistance (PmR) � for use in Volvox nuclear transformation we made different constructs in which the bacterial aphH gene encoding this ...

Translation of the abstract (English)

The amino-glycoside antibiotic paromomycin that is highly toxic to the green alga Volvox carteri is efficiently inactivated by aminoglycoside-3'-phosphotransferase from Streptomyces rimosus. In an attempt to develop a new dominant selectable marker � paromomycin resistance (PmR) � for use in Volvox nuclear transformation we made different constructs in which the bacterial aphH gene encoding this enzyme was combined with Volvox promoter elements. The construct that provided the most efficient transformation was one in which aphH was placed between a chimeric promoter that formed by fusing the Volvox hsp70 and rbcS3 promoters and the 3' UTR of the Volvox rbcS3 gene. When this plasmid was used in combination with a high-impact biolistic device, we obtained transformation rates about 15 times higher than we had achieved previously, and co-transformation of an unselected marker ranged about 30%. The chimeric aphH gene was stably integrated into the Volvox genome, frequently as tandem multiple copies, and was expressed at a level that made selection of PmR transformants simple and unambiguous. This recommends the engineered bacterial aphH gene as a new, highly efficient dominant selection marker for the transformation and co-transformation of a broad range of V. carteri strains without the recurring need for using auxotrophic recipient strains.

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