| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (3MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-4707
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10375
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 13 Februar 2006 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Karl. O. (Prof. Dr.) Stetter |
| Tag der Prüfung: | 20 Januar 2005 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) |
| Stichwörter / Keywords: | Genregulation , Transkription <Genetik> , Sulfolobus , Rudiviren , Rudiviren , SIRV , transcription , rudiviruses , SIRV |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10375 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine erste systematische und detaillierte Studie zur Genexpression von Viren hyperthermophiler Crenarchaeota in Abhängigkeit des Infektionszyklus durchgeführt. Als Modellsystem dienten dabei die Rudiviren SIRV1 und SIRV2 des hyperthermophilen Archaeums Sulfolobus. Mittels Northern-Hybridisierungen, bei denen sowohl doppelsträngige DNA-Sonden als auch ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine erste systematische und detaillierte Studie zur Genexpression von Viren hyperthermophiler Crenarchaeota in Abhängigkeit des Infektionszyklus durchgeführt. Als Modellsystem dienten dabei die Rudiviren SIRV1 und SIRV2 des hyperthermophilen Archaeums Sulfolobus. Mittels Northern-Hybridisierungen, bei denen sowohl doppelsträngige DNA-Sonden als auch einzelsträngige Oligonukleotidsonden verwendet wurden, wurden für beide Viren detaillierte Transkriptionskarten erstellt. Die Transkription beider Genome beginnt gleichzeitig ausgehend von einer Vielzahl an Startpunkten, die über das gesamte Genom verteilt liegen. Beide Stränge werden transkribiert, wobei keiner von beiden bevorzugt wird. Der früheste Zeitpunkt, zu dem Virus-spezifische Transkripte beobachtet werden konnten, lag bei 30 min. nach der Infektion. Zu diesem Zeitpunkt waren alle Leserahmen, bis auf ORF 55 (SIRV1)/55c (SIRV2), transkribiert. Viele Gene bilden Blöcke und werden als polycistronische Boten-RNAs transkribiert. Von einigen Genen wird zusätzlich zum polycistronischen Transkript zu einem späteren Zeitpunkt ein separates Transkript gebildet. Im Fall des Strukturprotein-Gens 134 konnte 2 bis 3 h nach der Infektion, unmittelbar vor dem Virusassembly, ein stark präsentes monocistronisches Transkript beobachtet werden. Ebenfalls spät konnte die separate Expression des unmittelbar nach dem Strukturptotein in Gegenrichtung gelegenen Gens 55 (55c) beobachtet werden, was möglicherweise mit der Regulation der Transkription des Strukturproteins in Zusammenhang stehen könnte.
13 Transkriptionsstartpunkte und deren zugehörige Promotorbereiche konnten mittels �Primer Extension�-Analyse experimentell identifiziert werden. Ähnlich wie die Wirts-Promotoren enthalten die Virus-Promotoren die bekannten Bindestellen für die archaeellen Transkriptionsfaktoren TATA-Bindeprotein (TBP) und Transkriptionsfaktor B (TFB). Darüber hinaus enthalten die meisten die drei Nukleotide lange, Virus-spezifische Konsensussequenz GTC, die die Beteiligung alternativer Transkriptionsfaktoren vermuten lässt.
Auf der Suche nach entsprechenden Faktoren wurde aufgrund der Ergebnisse der in vivo-Transkriptionsanalyse zunächst das Genprodukt des Leserahmen ORF 56 untersucht. Für das Gen konnte ein separates, kleines, stark presentes Transkript beobachtet werden, was eine mögliche regulatorische Funktion des Genprodukts vermuten läßt. Weiterhin konnte mittels Sequenzdatenanalyse im potentiellen Protein ein für DNA-Bindeproteine typisches Helix-turn-Helix Motiv identifiziert werden. In Gel-Verzögerungstests mit dem rekombinant hergestellten Protein wurde eine spezifische DNA-Bindung an ein palindromisches Sequenzmotiv in der eigenen Promotorregion nachgewiesen. Im in vitro-Transkriptionsexperiment war für das Protein jedoch kein deutlicher Effekt zu beobachtet.
Zur gezielten, Suche nach weiteren Transkriptionsfaktoren wurden Virus-Promotoren in DNA-Affinitätsreinigungsexperimenten eingesetzt. Dabei konnte aus Sulfolobus islandicus-Rohextrakt ein Protein gereinigt werden, welches als potentieller Trankriptionsfaktor SSo0048 identifiziert werden konnte. Für das native wie auch für das rekombinant hergestellte Protein konnte in in vitro-Transkriptionsexperimenten ein stimulierender Effekt auf die Initiation der Transkription nachgewiesen werden. Dadurch konnte ein neuer archaeeller, positiver Transkriptionsregulator gefunden werden. Um Hinweise auf die Funktionsweise des Faktors zu erhalten, wurde mittels DNAase I-Footprinting die Promotorbindestelle untersucht. Dabei konnte eine Bindestelle stromaufwärts vom BRE-Element und der TATA-Box gefunden werden und eine zweite stromabwärts, die teilweise in die TATA-Box und in das BRE-Element hineinreicht. Weiterhin wurde für den stimulierenden Effekt im in vitro-Experiment eine Abhängigkeit vom TATA-Bindeprotein gezeigt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In frame of this thesis a first systematic and detailed analysis of gene expression of viruses of hyperthermophilic crenarchaea over the infection cycle was carried out. As model served the two rudiviruses SIRV1 and SIRV2, infecting the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus. By means of northern-hybridization experiments, using double-stranded and single-stranded DNA probes, detailed ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In frame of this thesis a first systematic and detailed analysis of gene expression of viruses of hyperthermophilic crenarchaea over the infection cycle was carried out. As model served the two rudiviruses SIRV1 and SIRV2, infecting the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus. By means of northern-hybridization experiments, using double-stranded and single-stranded DNA probes, detailed transcription maps for both viruses were constructed. Transcription of both genomes starts simultaneously at multiple sites spread over the total length of the genome, and from both strands. The earliest time point when viral transcripts could be detected in cells was 30 min after infection. At this time point all viral genes, except one, were transcribed. Many genes cluster together and appear to be transcribed as polycistronic messengers. Although the coat protein-encoding gene is initially also transcribed as a polycistronic messenger, an abundant monocystronic transcript of this gene was detected 2-3 hrs after infection, just before assembly of viral particles. The expression of a single gene, adjacent to the coat protein gene, was upregulated at the late phase of infection, suggesting that it might be involved in specific processing and activation of the coat protein messenger. Start sites of thirteen transcripts from the SIRV1 genome have been mapped by primer extension, and promoter sequences were identified. Similar to host promoters, these viral promoters all contain potential binding sites for the archaeal transcription factors TATA Binding Protein (TBP) and Transcription Factor B (TFB). In addition, most of them contain a virus specific consensus element, suggesting the involvement of alternative transcription factors.
Searching for appropriate transcription factors, an apparent candidate seemed to be the putative protein encoded by ORF56. The transcript from its gene is abundant throughout the complete infection cycle. The small protein reveals a helix-turn-helix motif characteristic of many DNA binding proteins. While a specific binding of the recombinant protein to an inverted repeat in the gene promoter was shown in electric mobility shift assays, no effect could be observed in in vitro transcription experiments.
In search of further transcription factors, viral promoters were used in magnetic DNA affinity experiments. From crude extract of �Sulfolobus islandicus� a protein could be purified, which was identified as the annotated putative transcription factor SSo0048. For the native as well as for the recombinant protein a stimulating effect on transcription initiation of some viral promoters could be shown in in vitro transcription experiments. Furthermore, a TATA- binding protein dependent effect could be demonstrated for SSo0048. The promoter binding site was studied In DNase I�Footprinting experiments. One binding site could be identified upstream of the core promoter, a second downstream partly overlapping the TATA-box and the BRE element.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 13:08
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