Evolution und Regulation von Protein-Protein Interaktionen in zwei Glutamin-Amidotransferasen aus der Biosynthese von Histidin und Tryptophan

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-opus-5476
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.10400

Häger, Michaela C.

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Date of publication of this fulltext: 06 Nov 2006 07:41

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	5 November 2006
Referee:	Reinhard (Prof. Dr.) Sterner
Date of exam:	9 August 2005
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner
Keywords:	Histidinstoffwechsel , Tryptophanstoffwechsel , Glutaminamidotransferase , Allosterische Kontrolle , Molekulare Evolution , Protein-Protein-Wechselwirkung , Thermotoga maritima , Strukturanalyse , , histidine biosynthesis, Thermotoga maritima, molecular evolution, protein-protein interaction, glutamine-amidotransferase, allosteric regulation
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10400

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Abstract (German)

Abstract (German)

Glutamin-Amidotransferasen (GATasen) sind Bi-Enzymkomplexe, bestehend aus einer Glutaminase und einer Synthase, die als Modellenzyme zur Analyse von Protein-Protein Wechselwirkungen gut geeignet sind. Die Glutaminase erzeugt durch die Hydrolyse von Glutamin Ammoniak, der am aktiven Zentrum der Synthase mit einem spezifischen Substrat zu den für die jeweilige GATase charakteristischen Produkten reagiert. Besonders gut charakterisierte Vertreter der GATasen sind die Imidazolglycerinphosphat-Synthase (ImGP-S; 1:1 Komplex aus der Glutaminase HisH und der Synthase HisF) aus der Biosynthese des Histidin und die Anthranilat-Synthase (AS; 2:2 Komplex aus der Glutaminase TrpG und der Synthase TrpE) aus der Biosynthese des Tryptophan, deren Funktion und Evolution auf der Basis ihrer Röntgenstrukturen im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden.
Die beiden aktiven Zentren des HisH:HisF Komplexes aus Thermotoga maritima liegen etwa 25 Å voneinander entfernt und sind über einen Ammoniak-Kanal miteinander verbunden. Die Aufklärung der Kristallstrukturen verschiedener ligandierter HisH:HisF Komplexe in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Dr. Matthias Wilmanns am EMBL Hamburg führte zur Identifizierung von Aminosäuren an der Kontaktfläche, die mutmaßlich an der Kommunikation der beiden aktiven Zentrum beteiligt sind. Durch strukturelle und funktionelle Charakterisierung von HisH:HisF Komplexen, in denen diese Aminosäuren gegen Alanin ausgetauscht waren, konnten Aminosäuren, die an der Bindung von Glutamin in HisH mitwirken und eine wichtige Bedeutung für den Ablauf der ImGP-S Reaktion haben, identifiziert werden.
Darüber hinaus wurden an der Kontaktfläche von HisH ganze Sekundärstrukturelemente mit konservierten Aminosäuren durch die entsprechenden Abschnitte aus TrpG ersetzt, und umgekehrt. Diese Austausche führten zu keiner messbaren Änderung der Löslichkeit, Stabilität oder der Fähigkeit bzw. Unfähigkeit zur Komplexbildung mit HisF. Dagegen wurde der Oligomerisierungszustand (HisH ist ein Monomer, TrpG ist ein Dimer) durch die Austausche teilweise übertragen. Durch den wechselseitigen Austausch eines Sequenzabschnittes wurden die Glutaminase-Aktivitäten von TrpG und HisH unabhängig von der Anwesenheit von TrpE bzw. der Substratbindung an HisF. Für HisH konnte gezeigt werden, dass für diesen Übergang von einer konditionalen zu einer konstitutiven Glutaminaseaktivität eine konservierte Aminosäure verantwortlich ist.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Austausch größerer Sequenzbereiche zwischen HisH und TrpG zu keiner wesentlichen Beeinträchtigung der Struktur führt und in beiden Enzymen der �molekularer Schalter� zur Regulation der Glutaminase-Aktivität identifiziert werden konnte. Dies spricht für einen gemeinsamen evolutionären Ursprung von HisH und TrpG.

Translation of the abstract (English)

Glutamine amidotranferases (GATases) are bi-enzyme complexes, consisting of a synthase and a glutminase subunit, which are well suited to analyze protein-protein interactions. The glutaminase generates ammonia by hydrolyzing glutamine, which reacts at the active site of the synthase with a specific substrate to products that are characteristic of each GATase. The imidazole glycerol phosphate synthase (ImGP-S; 1:1 complex of the glutaminase HisH and the synthase HisF) from histidine biosynthesis and the anthranilate synthase (AS; 2:2 complex of the glutaminase TrpG and the synthase TrpE) from tryptophan biosynthesis are well-characterized GATases, whose function and evolution was analyzed here on the basis of their X-ray structures.
The two active sites within the HisH:HisF complex from Thermotoga maritima lie 25 Å apart from each other and are connected by an ammonia channel. The elucidation of several crystal structures of ligand-bound HisH:HisF complexes, which was achieved in cooperation with Dr. Matthias Wilmanns at the EMBL Hamburg, identified amino acids at the interface, which are presumably involved in the communication between the two active sites. Structural and functional characterization of HisH:HisF complexes, in which these residues have been replaced by alanine, identified a HisF residue involved in glutamine binding to HisH and HisH residues important for the ImGP-S reaction.
Furthermore, stretches of secondary structure elements containing conserved residues at the contact site of HisH were replaced by the corresponding sequences of TrpG, and vice versa. These exchanges did not cause measurable changes of solubilities, stabilities, and the ability or inability of binding to HisF. In contrast, the association state (HisH is a monomer, TrpG is a dimer) was transferred partly by the exchanges. The mutual exchange of one secondary structure element rendered the glutaminase activities of TrpG and HisH independent of the presence of the synthase TrpE or substrate binding to HisF. It was shown for HisH that one conserved amino acid is crucial for this conversion from a conditional to a constitutive glutaminase activity.
These data show that the mutual exchange of large sequence stretches between HisH and TrpG does not compromise their structural integrity, and that in both enzymes the molecular switch for the regulation of the glutaminase activity is located at the same position. These results support a common evolutionary origin of HisH and TrpG.

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