Therapie der CD62L+CD4+ Transferkolitis im Tiermodell durch Transfer von DX5+ NKT-Zellen

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Sattler, Christine

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Date of publication of this fulltext: 04 May 2006 07:44

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	3 May 2006
Referee:	Rüdiger (Prof. Dr.) Schmitt
Date of exam:	20 March 2006
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie
Keywords:	Colitis ulcerosa , Immunreaktion , Natürliche Killerzelle , Therapie , Tiermodell , NKT-Zellen , Transferkolitis , FACS , NKT cells , transfercolitis , FACS
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10430

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Abstract (German)

Abstract (German)

Die chronisch entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn (MC) wird durch eine überschießende Th1-Immunantwort auf bakterielle Antigene im Darm verursacht. Momentan ist keine Heilung für MC möglich. Eine vielversprechende Alternative in der MC-Therapie stellt eine Behandlung mit körpereigenen Zellen dar, die immunregulatorisch wirken. Eine solche Zellpopulation, die die Immunreaktion bei MC kontrollieren könnte, sind NKT-Zellen. Sie bewirken in vivo eine Unterdrückung von Th1-Immunantworten und sind in ihrer Entwicklung und Aktivierung meist abhängig vom MHC-Klasse-I-ähnlichen Molekül CD1d. Der klassische Marker für NKT-Zellen NK1.1 wird von einigen in Labors verwendeten Mausstämmen nicht exprimiert, so dass hier die Verwendung alternativer Marker für NKT-Zellen wie CD3/DX5 nötig ist. Um die Wirkung der DX5+ NKT-Zellen zu untersuchen wurde in der vorliegenden Arbeit eine Methode zur Isolierung von DX5+ NKT-Zellen aus der Milz von Balb/c-Mäusen mittels �magnetic activated cell sorting� (= MACS) entwickelt. Sowohl die im Tiermodell kolitisinduzierenden naiven T-Helfer-Zellen (CD62L+CD4+) als auch die DX5+ NKT-Zellen wurden durchflusszytometrisch anhand der Expression von Oberflächenmarkern charakterisiert. Die Wirkung der DX5+ NKT-Zellen wurde im Th1-vermittelten CD62L+CD4+ Transferkolitismodell in vitro und in vivo untersucht. Zusätzlich wurde die Wirkung von DX5+ NKT-Zellen im Modell der DSS-Kolitis in vitro überprüft. Die Charakterisierung im FACS zeigte, dass DX5+ NKT-Zellen eine gemischte Population aus CD4+ und CD4-CD8- NKT-Zellen darstellen. Sie exprimieren die Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und LFA-1. Nach 4tägiger Ko-Kultur mit DX5+ NKT-Zellen zeigte sich eine signifikant verringerte Zahl an CD62L+CD4+ Zellen im Vergleich zur Einzelkultur. Die Zahl an CD62LlowCD4+ Zellen, die im Tier keine Kolitis induzieren, wurde dagegen nicht vermindert. Dies zeigte sich auch in Ko-Kultur mit mononukleären Zellen aus Tieren mit DSS-Kolitis bzw. aus gesunden Tieren. Die Funktion der DX5+ NKT-Zellen war abhängig von direktem Zellkontakt und konnte nur teilweise durch einen Caspase-Inhibitor blockiert werden. Es zeigte sich auch eine Abhängigkeit von CD1d, PD-L1, CD40 und CD154. Der Transfer von DX5+ NKT-Zellen konnte bei präventiver Gabe zum Zeitpunkt der Kolitis-Induzierung im Tiermodell der CD62L+CD4+ Transferkolitis die Entstehung einer Kolitis verhindern. Ebenso konnten DX5+ NKT-Zellen eine bereits bestehende Kolitis deutlich verbessern. Meine Ergebnisse zeigen, dass DX5+ NKT-Zellen vielversprechende Ansätze für eine Therapie des MC mit immunregulatorischen Zellen liefern.

Translation of the abstract (English)

The inflammatory bowel disease Crohn´s disease (MC) is caused by an exaggerated immune response to bacterial antigens in the gut. At present there is no cure for IBD. Regulatory cell populations which can downregulate the exaggerated immune response in IBD patients could represent a promising alternative in the treatment of IBD. A cell population that could have these regulatory influences on IBD are NKT cells. These cells suppress Th1 immune responses and depend on the MHC-class-I-like molecule CD1d in their development and activation. However many mouse strains used in research do not express the classical marker for NKT cells NK1.1 so that the use of surrogate NKT-cell markers like CD3/DX5 in these strains is necessary. In this work a method for the purification of DX5+ NKT cells from the spleens of Balb/c mice by magnetic bead isolation (=MACS) was developed. Colitis-inducing naïve T-helper-cells (CD62L+CD4+) as well as DX5+ NKT cells were characterised by the expression of surface markers with flow cytometry. The function of DX5+ NKT cells was tested in vitro and in vivo in the Th1-mediated model of the CD62L+CD4+ transfercolitis. The effect of DX5+ NKT cells was also tested in vitro in the DSS-colitis model. The FACS-characterisation showed that DX5+ NKT cells represent a mixed population of CD4+ and CD4-CD8- NKT cells. They express the adhesion molecules ICAM-1 and LFA-1. After 4 days of coculture with DX5+ NKT cells the number of CD62L+CD4+ cells was significantly reduced in comparison to a single culture. The number of CD62LlowCD4+ cells which don´t induce colitis in animals was not reduced. This result could be confirmed in coculture with mononuclear cells from mice with DSS-colitis or from healthy mice respectively. The effect of DX5+ NKT cells was dependant on cell-cell-contact and could only partly be blocked by a caspase-inhibitor. DX5+ NKT-cells also showed dependence on CD1d, PD-L1, CD40 and CD154. In the CD62L+CD4+ transfercolitis model the transfer of DX5+ NKT cells at the time of colitis induction prevented colitis. The therapeutic administration of DX5+ NKT cells in animals with established colitis ameliorated the disease. My results show that DX5+ NKT cells are a promising approach for a therapy of MC with immunoregulatory cells.

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