Neuartige Tryptophan-Synthasen aus Hyperthermophilen: Charakterisierung der Enzyme aus Sulfolobus solfataricus

Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	1 August 2006
Begutachter (Erstgutachter):	Reinhard (Prof. Dr.) Sterner
Tag der Prüfung:	17 Januar 2006
Institutionen:	Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner
Stichwörter / Keywords:	Protein-Protein-Wechselwirkung , Biochemische Evolution , Extrem thermophile Bakterien , Molekulare Bioinformatik , Tryptophanstoffwechsel , Sulfolobus solfataricus , Multienzymkomplex , Strukturanalyse , Tryptophansynthase , Protein-Design , protein-protein interaction , protein evolution , computational analysis , trypophan biosynthesis
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	10434

Zusammenfassung (Deutsch)

In der vorliegenden Arbeit wurde die Tryptophan Synthase aus Sulfolobus solfataricus strukturell und funktionell untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Operon-ständigen Gene strpA und strpB2a, sowie das nicht Operon-ständige strpB2b getrennt in Escherichia coli exprimiert, die Genprodukte gereinigt und charakterisiert. sTrpB2a und sTrpB2b katalysieren mit vergleichbar hoher Effizienz die ...

Zusammenfassung (Deutsch)

In der vorliegenden Arbeit wurde die Tryptophan Synthase aus Sulfolobus solfataricus strukturell und funktionell untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Operon-ständigen Gene strpA und strpB2a, sowie das nicht Operon-ständige strpB2b getrennt in Escherichia coli exprimiert, die Genprodukte gereinigt und charakterisiert. sTrpB2a und sTrpB2b katalysieren mit vergleichbar hoher Effizienz die Synthese von Tryptophan aus Serin und Indol. Während sTrpB2b nicht mit sTrpA interagiert, bilden sTrpB2a und sTrpA einen schwachen, möglicherweise transienten Komplex. Durch diese Komplexbildung kommt es zu einer Aktivierung von sTrpA, eine Aktivierung von sTrpB2a konnte nicht nachgewiesen werden.
Um die strukturellen Unterschiede zwischen sTrpB2a und sTrpB2b, die über eine Interaktion mit sTrpA entscheiden festzulegen, wurde die Kontaktfläche zwischen sTrpB2a und sTrpA mit bioinformatischen Methoden analysiert. Ausgewählte Positionen wurden einer gezielten Mutagenese unterworfen und die Proteinvarianten gereinigt und charakterisiert. Eine Deletion von drei Aminosäuren in sTrpB2a führte dabei zu einer deutlichen Schwächung der Komplexbildung mit sTrpA.
Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen ein Schema für die Evolution der Tryptophan Synthase entwickeln. Ausgehend von einem frühen Vorläufer führte Genduplikation zur Existenz von zwei trpB-Genen, von denen eines im trp-Operon vorliegt. Aus dem im trp-Operon kodierten TrpB Protein entwickelte sich durch Optimierung der Kontaktfläche, ausgehend von einer schwachen Interaktion, der Tryptophan Synthase Komplex heutiger mesophiler Bakterien.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

The structure and function of the tryptophan synthase from Sulfolobus solfataricus were investigated. To this end, the strpA and strpB2a genes of the trp operon, as well as the strpB2b gene that is located outside the trp operon, were expressed individually in Escherichia coli, and the gene products were purified and characterized. Both sTrpB2a and sTrpB2b catalyze the biosynthesis of tryptophan ...

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

The structure and function of the tryptophan synthase from Sulfolobus solfataricus were investigated. To this end, the strpA and strpB2a genes of the trp operon, as well as the strpB2b gene that is located outside the trp operon, were expressed individually in Escherichia coli, and the gene products were purified and characterized. Both sTrpB2a and sTrpB2b catalyze the biosynthesis of tryptophan from serine and indole with comparable efficiency. While sTrpB2b does not interact with sTrpA, sTrpB2a forms a weak, potentially transient complex with sTrpA. This complex formation leads to an activation of sTrpA, an activation of sTrpB2a was not detectable.
To determine the structural differences between sTrpB2a and sTrpB2b which are responsible for complex formation, the contact site was analyzed using computer based methods. Selected positions were mutated and the protein variants were characterized. A deletion of three amino acids in sTrpB2a lead to a significant weakening of the complex formation with sTrpA.
Taken together a scheme for the evolution of the tryptophan synthase was developed. Starting from an ancient trpB gene, gene duplication lead to the existence of two copies, one located in the trp operon. The TrpB protein encoded in the operon evolved the ability to interact with TrpA and optimisation of the contact site lead to the tryptophan synthase complex known from mesophile bacteria today.

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