Analyse der Funktion des Photorezeptors Channelrhodopsin 1 der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	24 April 2007
Referee:	Peter (Prof. Dr.) Hegemann
Date of exam:	4 April 2006
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie
Keywords:	Rhodopsin , RNS-Interferenz , Chlamydomonas reinhardii , Phototaxis , Tagesrhythmus , Photorezeptor , , rhodopsin , RNA-interference , phototaxis
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 580 Botanical sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10495

Abstract (German)

Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii besitzt sieben potentielle Photorezeptorproteine, die zur Familie der Rhodopsine gehören und für lichtinduzierte Bewegungsantworten von C. reinhardtii verantwortlich sein könnten. Zwei der sieben Photorezeptorproteine konnten als lichtgesteuerte Ionenkanäle identifiziert werden, während die Funktion der anderen fünf Rhodopsine noch unbekannt ist. ...

Abstract (German)

Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii besitzt sieben potentielle Photorezeptorproteine, die zur Familie der Rhodopsine gehören und für lichtinduzierte Bewegungsantworten von C. reinhardtii verantwortlich sein könnten. Zwei der sieben Photorezeptorproteine konnten als lichtgesteuerte Ionenkanäle identifiziert werden, während die Funktion der anderen fünf Rhodopsine noch unbekannt ist. Dabei handelte es sich um den Protonenkanal Channelrhodopsin 1 (ChR1) und den Kationen-Kanal Channelrhodopsin 2 (ChR2). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression dieser beiden Kanalrhodopsine in Chlamydomonas analysiert, und die Funktion von Channelrhodopsin 1 an RNAi-Mutanten mit reduziertem ChR1-Gehalt untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:
Mittels in dieser Arbeit generierter polyklonaler Antikörper konnten die beiden Kanalrhodopsine in Zellextrakten von Chlamydomonas identifiziert und deren Expression charakterisiert werden. ChR1, das ein Molekulargewicht von etwa 70 kDa besitzt, wird in Wildtypzellen (CC124mt-) und in der Zellwandmutante cw2 sowohl in vegetativen Zellen als auch in Gameten gleich stark exprimiert, wobei die Expression offensichtlich der circadianen Steuerung unterliegt. ChR1 besitzt mindestens eine in vivo ausgebildete Disulfidbindung bildet, die durch eine intermolekulare Wechselwirkung mit einem zweiten ChR1-Protein (Homodimer) oder mit einem noch unbekannten Protein (Heterodimer) zustande kommt. ChR2 besitzt ein Molekulargewicht von etwa 60 kDa und wird in Gameten der Zellwandmutante cw2 nur schwach exprimiert. Mittels der RNAi-Technik wurden cw2-Transformanten mit reduziertem ChR1-Gehalt erzeugt. An diesen Mutanten konnte mittels Bewegungsanalysen gezeigt werden, dass es sich bei ChR1 um den Photorezeptor für die phototaktische und photophobische Reaktion handelt. Schließlich konnte mittels elektrophysiologischen Messungen gezeigt werden, dass die Amplitude der Photorezeptorströme von der ChR1-Konzentratino abhängig ist. Immunofluoreszenz-Analysen ergaben, dass ChR1 und ChR2 innerhalb der Zelle im Bereich des Augenflecks von Chlamydomonas lokalisiert sind.

Translation of the abstract (English)

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii uses seven rhodopsin-like photoreceptors for responding to light. A few years ago two microbial-type rhodopsins, Channelrhodopsin 1 (ChR1) and Channelrhodopsin 2 (ChR2), have been identified as light gated ion channels. Heterologous expression in Xenopus oocytes revealed that ChR1 acts as a light-gated proton channel, whereas ChR2 conducts ...

Translation of the abstract (English)

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii uses seven rhodopsin-like photoreceptors for responding to light. A few years ago two microbial-type rhodopsins, Channelrhodopsin 1 (ChR1) and Channelrhodopsin 2 (ChR2), have been identified as light gated ion channels. Heterologous expression in Xenopus oocytes revealed that ChR1 acts as a light-gated proton channel, whereas ChR2 conducts cations in a size-dependent manner. During this work, polyclonal antibodies were generated against ChR1 and ChR2 and the expression of both proteins was analyzed by western blotting. It was shown that ChR1 is expressed in a light dependent manner with a molecular weight of nearly 70 kDa and contains at least one inter-molecular disulfide bond thereby forming a multimer in vivo. ChR2 was expressed with a molecular weight of approximately 60 kDa. ChR1 and ChR2 are present in vegetative cells, whereas gametes of the cell-wall deficient mutant cw2 mainly contain ChR1. cw2 antisense-transformants were generated that express reduced amounts of ChR1. By measuring phototaxis by light scattering and photophobic responses by motion analysis it was demonstrated that in this strain both behavioral responses are controlled only by ChR1. Recording of photoreceptor currents confirms this conclusion since the current amplitude parallels the ChR1 concentration in the cell. Finally, immunofluorescence imaging confirms that ChR1 and ChR2 are localized in the eyespot area.

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