| License: Publishing license for publications including print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-10441
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12133
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 29 September 2009 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 24 July 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | Barrel <alpha, beta-> , Proteine , Molekulare Evolution , Proteinfaltung , Strukturanalyse , (beta/alpha)2-Module , HisF , Imidazolglycerinphosphat Synthase , (beta/alpha)8-barrel fold , (beta/alpha)2-unit , HisF , Imidazolglycerolphosphatsynthase , evolution |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12133 |
Abstract (German)
Die (beta/alpha)8-barrel Faltung besteht auf den ersten Blick aus einer einzigen Domäne. Es gibt jedoch Hinweise, dass dieser Faltungstyp aus zwei (beta/alpha)4-halbbarrel entstanden ist. Die bereits früher charakterisierten N- und C-terminalen Hälften der Imidazolglycerinphosphat Synthase (HisF) aus Thermotoga maritima, HisF_N [(beta/alpha)1-4] und HisF_C [(beta/alpha)5-8], wurden erneut ...
Abstract (German)
Die (beta/alpha)8-barrel Faltung besteht auf den ersten Blick aus einer einzigen Domäne. Es gibt jedoch Hinweise, dass dieser Faltungstyp aus zwei (beta/alpha)4-halbbarrel entstanden ist. Die bereits früher charakterisierten N- und C-terminalen Hälften der Imidazolglycerinphosphat Synthase (HisF) aus Thermotoga maritima, HisF_N [(beta/alpha)1-4] und HisF_C [(beta/alpha)5-8], wurden erneut heterolog in E. coli exprimiert und mithilfe eines optimierten Protokolls aufgereinigt. Analytische Gelfiltration zeigte, dass sich die Hälften zum jeweiligen Homodimer zusammenlagern. HisF_N wird dabei über ein bisher nicht identifiziertes Cystin stabilisiert. Beide Proteine besitzen native Sekundär- und Tertiärstrukturen, die in chemischen Auffaltungssexperimenten kooperativ denaturieren. Diese Ergebnisse stützen die früher getroffene Aussage, dass es sich bei den (beta/alpha)4-Einheiten um Vorläufereinheiten der (beta/alpha)8-barrel Faltung handelt.
Sequenz- und Strukturuntersuchungen deuteten aber auch auf eine vierfache Symmetrie innerhalb der (beta/alpha)8¬-barrel Faltung hin. Diese findet sich auch in HisF, dessen vier (beta/alpha)2-Einheiten HisF_N1 [(beta/alpha)1-2], HisF_N2 [(beta/alpha)3-4], HisF_C1 [(beta/alpha)5-6] und HisF_C2 [(beta/alpha)7-8] Sequenz- und Strukturähnlichkeiten aufweisen. Diese Befunde deuten darauf hin, dass HisF aus einem (beta/alpha)2-Vorläuferbarrel entstanden sein könnte. Diese Hypothese sollte durch die Herstellung und Charakterisierung der HisF-Viertel überprüft werden. Dazu wurden die Viertel heterolog in E. coli exprimiert.
Bei den Reinigungsversuchen zeigte sich, dass HisF_N2 und HisF_C2 in isolierter Form nicht stabil waren. Nach Fusion mit der Glutathion S-Transferase (GST) sind beide Proteine zwar nachweisbar, können aber nach Abtrennung der GST nicht in Lösung gehalten werden. Deshalb wurden HisF_N2 und HisF_C2 mithilfe der Festphasenpeptidsynthese dargestellt. Auch hier zeigte sich, dass die Proteine keine native Faltung annehmen und erst mit dem Kosolvens TFE in Lösung zu bringen sind. Ein Grund dürfte in der unzureichenden Länge der Polypeptidketten mit 48 (HisF_N2) bzw. 58 Aminosäureresten (HisF_C2) liegen, die wohl zu kurz sind, um korrekt zu falten.
HisF_N1, bestehend aus 74 Aminosäuren, bildet wie HisF_N ein Homodimer über ein Cystin. Analytische Gelfiltration, chemisches cross-linking und analytische Ultrazentrifugation ergaben, dass sich zwei Homodimere zum Tetramer zusammenlagern und somit vermutlich ein vollständiges (beta/alpha)8-barrel ausbilden. Fern-UV CD- und Fluoreszenzemissionsspektroskopie zeigten, dass das (HisF_N1)4-Molekül in Lösung native Sekundär- und Tertiärstruktur aufweist. Die schwach kooperative Entfaltung der Sekundärstruktur mittels Harnstoff belegt, dass es sich um ein stabiles Protein handelt. Versuche zur weiteren Stabilisierung von HisF_N1 mittels rationalem Design schlugen fehl.
HisF_C1, ebenfalls aus 74 Aminosäuren bestehend, erwies sich als weniger stabil als HisF_N1, besitzt aber Anteile nativer Sekundär- und Tertiärstruktur. In Lösung liegt HisF_C1 als Gemisch von Mono-, Tetra- und höheren Oligomeren vor. Nach Einführung von zwei Aminosäureaustauschen (A128C und Y143H) bildet auch HisF_C1 ein Tetramer, wie durch analytische Gelfiltration, chemisches cross-linking und analytische Ultrazentrifugation gezeigt werden konnte. Während Y143H die Löslichkeit fördert, wird durch A128C die Ausbildung eines Cystins induziert, worauf sich � analog zu HisF_N1 � zwei kovalent verknüpfte Homodimere zum Tetramer zusammenlagern. Auffaltungskurven zeigten, dass die beiden Aminosäureaustausche auch zu einer Stabilitätserhöhung im Vergleich zum wildtypischen HisF_C1 führen. Eine weitere leichte Stabilisierung gelang durch den Austausch E167Q, der mit dem Ziel der Rekonstruktion eines Wasserstoffbrückennetzes im zentralen beta-barrel eingeführt wurde.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Modell zur Evolution von (beta/alpha)8-barrels aus (beta/alpha)2-Einheiten erstellt. Demnach lagerten sich zunächst zwei identische (beta/alpha)2-Einheiten zum über ein Cystin stabilisierten Homodimer zusammen. Durch die Assoziation zweier Homodimere zum Tetramer bildete sich eine erste (beta/alpha)8-barrel Struktur aus. Im nächsten Schritt kam es zur Duplikation und in tandem Fusion des (beta/alpha)2-Gens. Das Produkt des resultierenden (beta/alpha)4-Gens lagerte sich über eine oder mehrere Disulfidbrücken zum Homodimer zusammen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden zwei hisF_N1 Gene in tandem fusioniert und das resultierende hisF_N1N1-Gen in E. coli exprimiert. Das erzeugte rekombinante Protein HisF_N1N1 besitzt native Sekundär- und Tertiärstruktur, ist vergleichbar stabil wie das (beta/alpha)4-Halbbarrel HisF_N und bildet wie dieses in Lösung ein Homodimer.
Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern Hinweise darauf, dass es sich bei HisF_N1 und HisF_C1 um eigenständige Domänen handelt, die Eigenschaften einer ursprünglichen (beta/alpha)2-Einheit aufweisen. HisF_N1 ist dabei wohl die ursprünglichere (beta/alpha)2-Einheit, da es von vorneherein ein Tetramer bildet und nicht erst wie HisF_C1 durch gezielte Aminosäureaustausche stabilisiert werden musste.
Translation of the abstract (English)
At first view the (beta/alpha)8-barrel fold consists of a single domain. But there are several hints that this fold evolved from two halfbarrels. The N- and C-terminal halves of the Imidazolglycerolphosphatsynthase (HisF) from Thermotoga maritima, namely HisF_N [(beta/alpha)1-4] and HisF_C [(beta/alpha)5-8], were expressed heterologously in E. coli and purified with an optimized protocol. ...
Translation of the abstract (English)
At first view the (beta/alpha)8-barrel fold consists of a single domain. But there are several hints that this fold evolved from two halfbarrels. The N- and C-terminal halves of the Imidazolglycerolphosphatsynthase (HisF) from Thermotoga maritima, namely HisF_N [(beta/alpha)1-4] and HisF_C [(beta/alpha)5-8], were expressed heterologously in E. coli and purified with an optimized protocol. Analytical gel filtration showed that these two halves form a homodimer. In the case of HisF_N the homodimer is stabilized through a not yet detected cystine. Both proteins adopt secondary and tertiary structure, which denature cooperatively during chemical unfolding experiments. These results underscore the former hypothesis, that the (beta/alpha)4-unit is an autonomous domain and can be seen as an ancestral unit in the evolution of the (beta/alpha)8-fold. Amino acid and structural analyses suggested also a fourfold symmetry within the (beta/alpha)8-fold. The four (beta/alpha)2-units, namely HisF_N1 [(beta/alpha)1-2], HisF_N2 [(beta/alpha)3-4], HisF_C1 [(beta/alpha)5-6] and HisF_C2 [(beta/alpha)7-8] exhibit sequence and structure similarities. These findings indicate that HisF may have evolved from an ancestral (beta/alpha)2-unit. This hypothesis should be tested by the biophysical and biochemical characterisation of the HisF-quarters after heterologous expression in E. coli.
The purification trials of HisF_N2 and HisF_C2 showed that these proteins are not stable in isolated form. Fusion to glutathione-S-transferase (GST) made the polypeptides detectable, but after removing of GST the two (beta/alpha)2-units lost their solubility. Because of this result the two proteins were synthesized via solid phase peptide synthesis. The proteins adopted no native structure and could only stay soluble in the presence of the cosolvens TFE. One reason could be that the proteins are not able to fold correctly because of the insufficient length of the polypeptide chains of 48 (HisF_N2) and 58 (HisF_C2) residues.
HisF_N1, consisting of 74 residues, forms like HisF_N a homodimer via an intermolecular cystine. Analytical gel filtration, chemical cross-linking and analytical ultracentrifugation suggested that two homodimers form a tetramer, resulting in the complete (beta/alpha)8-barrel topology. Far UV-CD- and fluorescence spectroscopy showed that [HisF_N1]4 adopts secondary and tertiary structure. The weak cooperative unfolding of the secondary structure showed that the protein is stable but less compact. The stabilisation of the protein via rational design did not succeed.
HisF_C1, consisting of 74 residues, is less stable than HisF_N1. This protein also adopts secondary and tertiary structure. HisF_C1 forms a mixture of mono-, tetra- and higher oligomers in solution. After two amino acid exchanges (A128C and Y143H) the equilibrium is shifted completely to the tetramer, which was shown via analytical gel filtration, chemical cross-linking and analytical ultracentrifugation. Y143H increased the solubility and A128C induced the formation of a cystine in HisF_C1, which led to homodimer-formation first and then to the formation of a tetramer. The HisF_C1 variant is more stable during chemical unfolding than wild type HisF_C1. The amino acid exchange E167Q, which enables the establishment of an H-bond network in the central beta-barrel resulted in another low increase of stability.
Based on these results a model for the evolution of the (beta/alpha)8-barrel fold from (beta/alpha)2-units has been compiled. In this model two identical (beta/alpha)2-units form a homodimer via formation of an intermolecular cystine. Two homodimers associate to a tetramer with (beta/alpha)8-barrel topology. After duplication and fusion of the ancestral (beta/alpha)2-gene the resulting (beta/alpha)4-halfbarrel protein can also form homodimers via one or two cystines. To test this model two hisF_N1 genes were fused and the resulting hisF_N1N1 gene was expressed heterologously in E. coli. The recombinant protein forms a dimer, adopts native like secondary as well as tertiary structure and is as stable as HisF_N.
The results of this work provide first hints that HisF_N1 and HisF_C1 are independent domains with attributes of an ancestral (beta/alpha)2-unit. HisF_N1 might be the primordial unit, because this protein is able to form a tetramer which cannot be stabilized by rational design like HisF_C1.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 11:20
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