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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-11300
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 11 November 2009 |
| Referee: | Reinhard (PD Dr.) Rachel |
| Date of exam: | 18 December 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie |
| Keywords: | Biomembran , Elektronenmikroskopie , Molekulare Bioinformatik , Sekundärstruktur , Oligomerisation , Wirt , Parasit , Membranproteine , Archaeen , elektrophysiologische Studien , Ignicoccus hospitalis , Nanoarchaeum equitans , Membranporen , Proteinanalytik , archaea , electrophysiological studies , membrane pores , protein analytics , electron microscopy |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12137 |
Abstract (German)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des dominierenden Oberflächenproteins von I. hospitalis sowie die Identifikation weiterer, potenziell am Aufbau der Kontaktstelle zwischen I. hospitalis und N. equitans beteiligter Proteinspezies. Mit Ihomp1 (Ignicoccus hospitalis outer membrane protein 1) konnte das erste Protein einer bislang einzigartigen ...
Abstract (German)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des dominierenden Oberflächenproteins von I. hospitalis sowie die Identifikation weiterer, potenziell am Aufbau der Kontaktstelle zwischen I. hospitalis und N. equitans beteiligter Proteinspezies.
Mit Ihomp1 (Ignicoccus hospitalis outer membrane protein 1) konnte das erste Protein einer bislang einzigartigen Membranstruktur in der Domäne der Archaeen charakterisiert werden. Es handelt sich entsprechend bioinformatischer Recherchen um ein kleines, funktionell uncharakterisiertes Protein (6,3 kDa), welches keine signifikanten strukturellen Homologien zu bekannten Proteinspezies aufweist. Wie im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, repräsentieren die durch Ihomp1 gebildeten homooligomeren 45 bzw. 50 kDa-Komplexe die funktionelle Einheit der dominierenden, Transmembranporen-formenden 7 nm-Partikel der Zelloberfläche von I. hospitalis und erfüllen möglicherweise eine Funktion in der Versorgung des Organismus mit Nährstoffen, wie dem terminalen Elektronenakzeptor Polysulfid. So konnte durch elektrophysiologische Einzelkanalstudien in künstlichen Systemen bereits eine signifikante Leitfähigkeit der Ihomp1-Komplexe nachgewiesen werden.
Immunzytologische Studien an Gefrierätzpräparaten der drei bekannten Spezies der Gattung Ignicoccus belegten, dass es sich bei Ihomp1 um ein spezies-spezifisch exprimiertes Protein handelt. Vorläufige PCR-Analysen wiesen zudem auf ein ebenfalls auf I. hospitalis beschränktes Vorkommen des korrespondierenden Gens igni_1266 hin.
Für die strukturelle und funktionelle Charakterisierung der nativen Ihomp1-Komplexe wurde ein mehrstufiges Aufreinigungsprotokoll etabliert. Mit Hilfe umfangreicher massenspektrometrischer sowie bioinformatischer und CD-spektroskopischer Analysen konnte so für die beiden stabilen 45 und 50 kDa Ihomp1-Komplexe eine einheitliche Stöchiometrie aus zehn Monomeren bestimmt werden, welche die Membran in alpha helikaler Form durchspannen. Eine röntgenkristallographische Untersuchung der Komplexe ist in Bearbeitung. Entsprechend vorläufiger gelchromatographischer Daten wird zudem eine Funktion des Proteins in der Initiation der Zell-Zell-Interaktion zwischen I. hospitalis und N. equitans als spezifisches Erkennungs- bzw. Bindemotiv für das S-Layer-Protein NEQ300 aus N. equitans diskutiert.
Im Rahmen der proteinanalytischen Untersuchung der Membranfraktionen aus Rein- und Co-Kultur konnte die Expression von mehr als 280, in den Genomen von I. hospitalis und N. equitans annotierten Proteinspezies nachgewiesen werden. Die Interpretation der daraus gewonnenen Daten in Bezug auf eine mögliche Funktion dieser Proteine im Austausch zwischen I. hospitalis und N. equitans ist jedoch deutlich erschwert, da bioinformatischen Recherchen zufolge für einen Großteil der so identifizierten, mutmaßlichen Membranproteine der beiden Spezies gegenwärtig keine physiologische Funktion vorhergesagt werden kann.
Translation of the abstract (English)
The aims of the current thesis were the structural and functional characterization of the dominating surface protein of Ignicoccus hospitalis - Ihomp1 - as well as the identification of further protein species potentially involved in the formation of the interaction side between I. hospitalis and N. equitans. With Ihomp1 (Ignicoccus hospitalis outer membrane protein 1) we could identify and ...
Translation of the abstract (English)
The aims of the current thesis were the structural and functional characterization of the dominating surface protein of Ignicoccus hospitalis - Ihomp1 - as well as the identification of further protein species potentially involved in the formation of the interaction side between I. hospitalis and N. equitans.
With Ihomp1 (Ignicoccus hospitalis outer membrane protein 1) we could identify and characterize the first and so far only known protein constituent of the unique outer membrane of I. hospitalis. It is a small, functionally uncharacterized protein (6.23 kDa) which shows no significant structural homology to other known protein species. Ihomp1 is able to form homooligomeric 45 and 50-kDa-complexes representing the functional unit of the dominating transmembrane pore forming 7 nm-particles in the outermost sheath of the I. hospitalis cell envelope, and could possibly be involved in providing the cell with essential nutrients. This assumption amongst others is based on a significant conductance determined from purified Ihomp1-complexes by electrophysiological studies in planar artificial membranes.
Immuncytological studies on freeze etch preparations of each of the three known species of the genus Ignicoccus revealed a species-specific expression of Ihomp1. Based on preliminary PCR analysis, the distribution of the corresponding gene igni_1266 seems as well to be constricted to I. hospitalis.
To enable a structural and functional characterization of the native Ihomp1-complexes, a multistage purification protocol was established which includes two ion exchange steps followed by a size exclusion chromatography. Comprehensive analysis of the two stable 45 and 50 kDa Ihomp1-complexes using mass spectrometry, bioinformatics and CD spectroscopy revealed a consistent homodecameric stoichiometry and an alpha helical transmembrane segment in the primary structure of the Ihomp1-protein. X-ray crystallography of theses complexes is under examination. Preliminary gel chromatographic data also suggest a role of Ihomp1 in the initiation of the cell-cell interaction between I. hospitalis and N. equitans as a specific recognition or binding motive for the S-layer protein NEQ300 from N. equitans.
In the course of a quantitative protein analytical study of the membrane fractions from a pure I. hospitalis culture and a co-culture of I. hospitalis and N. equitans we were able to validate the expression of more than 280 predicted protein coding sequences in both genomes. While being annotated as hypothetical proteins or proteins with general functions, almost one third of the identified proteins were classified as functionally uncharacterized so that a reliable interpretation of these data regarding a putative role of these proteins in the interaction between the two archaea is hardly possible at present. These data open the door for further analysis of this unique intimate association between I. hospitalis and N. equitans for example regarding the sub cellular localization of some of the identified proteins in order to verify the protein constitution of the putative interaction complex.
Metadata last modified: 03 Jun 2018 21:33
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