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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-10942
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12143
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 17 December 2009 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 28 October 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | Barrel <alpha, beta-> , molekulare Evolution , gerichtete Evolution , Rationales Design , Barrel <alpha, beta-> , molecular evolution , directed evolution , rational design |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12143 |
Abstract (German)
In der vorliegenden Dissertation wurde die molekulare Evolution neuer (beta/alpha)8-Barrel Enzyme durch die Rekombination von existierenden (beta/alpha)4-Halbbarreln experimentell untersucht. Dieser Arbeit liegt das Modell zugrunde, wonach die Vielfalt heutiger (beta/alpha)8-Barrel Enzyme durch eine Reihe von Duplikationen, Fusionen und Rekombinationen aus einem gemeinsamen Vorfahren halber ...
Abstract (German)
In der vorliegenden Dissertation wurde die molekulare Evolution neuer (beta/alpha)8-Barrel Enzyme durch die Rekombination von existierenden (beta/alpha)4-Halbbarreln experimentell untersucht.
Dieser Arbeit liegt das Modell zugrunde, wonach die Vielfalt heutiger (beta/alpha)8-Barrel Enzyme durch eine Reihe von Duplikationen, Fusionen und Rekombinationen aus einem gemeinsamen Vorfahren halber Länge - dem (beta/alpha)4-Halbbarrel � entstanden ist. In bisherigen Arbeiten konnte durch Duplikation und Fusion eines (beta/alpha)4-Halbbarrels und anschließender Optimierung der Kontaktfläche ein stabiles (beta/alpha)8-Barrel Enzym hergestellt werden. Um auch den Mechanismus der Genrekombination experimentell nachzuvollziehen, wurden aus den (beta/alpha)8-Barrel Enzymen ProFAR Isomerase (HisA) und Imidazolglycerinphosphat Synthase (HisF) aus Thermotoga maritima chimäre Proteine hergestellt. Dazu wurde das N-terminale (beta/alpha)4-Halbbarrel von HisA mit dem C-terminalen (beta/alpha)4-Halbbarrel von HisF zu HisAF kombiniert, sowie in analoger Weise HisFA erzeugt. Biophysikalische Charakterisierungen der Chimären im Vorfeld dieser Arbeit deuteten darauf hin, dass es sich insbesondere bei HisAF um ein kompaktes Protein mit definierter Struktur handelt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte nunmehr katalytische Aktivität auf HisAF etabliert werden. Da für die Etablierung katalytischer Aktivität auf HisAF keine hoch aufgelöste Struktur zur Verfügung stand, wurde dazu ein Ansatz der gerichteten Evolution gewählt. Auf den Elternenzymen HisA und HisF konnte bereits schwache PRA-Isomerase (TrpF) Aktivität etabliert werden, weswegen dies ebenfalls für HisAF versucht wurde. Dazu wurden Zellen eines trpF-Deletionsstammes (deltatrpF) mit einer durch fehlerbehaftete PCR hergestellten hisAF-Genbank transformiert und mittels in vivo Komplementation in festem bzw. flüssigem Minimalmedium ohne Tryptophan auf aktive Varianten selektiert. Vier der komplementierenden HisAF-Varianten, die zwischen 1�5 Aminosäureaustausche trugen, wurden exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Die rekombinanten Proteine zeigten schwache TrpF-Aktivität in vitro (kcat/KMPRA = 0,1�6,8 mM-1min-1), die jedoch durch die gezielte Kombination von Austauschen schrittweise um mehrere Größenordnungen verbessert werden konnte. Die beste Variante HisAFcomIII, die insgesamt sieben Aminosäureaustausche enthält, weist einen kcat/KMPRA von 1425 mM-1min-1 auf. Während die Wechselzahl mit 4 min-1 etwa 50-fach unterhalb der wildtypischer TrpF Enzyme liegt, entsprechen die Werte für die Michaeliskonstante (KMPRA = 2,9 µM) und die Dissoziationskonstante für die Bindung eines Produktanalogons (KdrCdRP = 5,6 µM) weitgehend den entsprechenden Werten für TrpF aus E. coli. Die Herstellung weiterer Genbanken auf der Basis von HisAFcomIII führte zur Isolierung schneller komplementierender Varianten, deren TrpF-Aktivität in vitro jedoch nur unwesentlich erhöht war. Vermutlich geht die verbesserte in vivo Aktivität dieser Proteine auf eine erhöhte konformationelle Stabilität zurück.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden ausgewählte Mutationen, die bei der Selektion auf TrpF-Aktivität von HisAF gefunden wurden, in die Elternenzyme HisA und HisF übertragen. Die bereits früher gefundene geringe TrpF-Aktivität von HisF-D130V konnte dadurch nur geringfügig verbessert werden. Hingegen führte in der früher charakterisierten HisA-H75Y+F111S+D127V Variante der zusätzliche Austausch D169V zu einer drastischen Erhöhung der Aktivität auf kcat/KMPRA = 4335 mM-1min-1. Besonders bemerkenswert ist, dass die Wechselzahl dieses Proteins mit 67 min-1 etwa 30 % des Wertes für TrpF aus T. maritima erreicht und höher liegt als die Wechselzahl von wildtypischem HisA für die native HisA-Reaktion. In Kooperation mit Dr. Birte Höcker wurde diese HisA-Variante kristallisiert und ihre Röntgenstruktur mit einer Auflösung von 1,8 Å aufgeklärt. Derzeit wird PRA in das aktive Zentrum des Proteins modelliert, um die mechanistischen Grundlagen für die hohe TrpF-Aktivität zu verstehen.
Insgesamt unterstützen die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse die Hypothese, dass es im Verlauf der Evolution der (beta/alpha)8-Barrel Enzyme zur Rekombination von (beta/alpha)4-Halbbarreln gekommen ist. Sie zeigen weiterhin, dass sich das (beta/alpha)8-Barrel Proteingerüst zur de novo Etablierung wildtypähnlicher enzymatischer Aktivität eignet.
Translation of the abstract (English)
In this work, the molecular evolution of new (beta/alpha)8-barrel enzymes has been experimentally examined by recombining existing (beta/alpha)4 half-barrels. The thesis is based on the hypothesis that the present-day diversity of (beta/alpha)8-barrel enzymes has been generated from an ancestral (beta/alpha)4 half-barrel by a series of gene duplications, fusions and recombinations. In previous ...
Translation of the abstract (English)
In this work, the molecular evolution of new (beta/alpha)8-barrel enzymes has been experimentally examined by recombining existing (beta/alpha)4 half-barrels.
The thesis is based on the hypothesis that the present-day diversity of (beta/alpha)8-barrel enzymes has been generated from an ancestral (beta/alpha)4 half-barrel by a series of gene duplications, fusions and recombinations. In previous publications, stable (beta/alpha)8-barrel enzymes have been generated by duplication and fusion of a (beta/alpha)4 half-barrel, and subsequent optimization of the contact interface. Here, in order to experimentally mimic the mechanism of gene recombination, chimeric proteins were constructed from the (beta/alpha)8-barrel enzymes ProFAR isomerase (HisA) and imidazole glycerol phosphate synthase (HisF) from Thermotoga maritima. To this end, the N-terminal (beta/alpha)4 half-barrel of HisA was combined with the C-terminal (beta/alpha)4 half-barrel of HisF to yield HisAF; in an analogous manner, HisFA was also constructed. Biophysical characterizations of the chimeras prior to this work indicated that HisAF is a compact protein with a defined three-dimensional structure.
The overall goal of this thesis was to establish catalytic activity on the HisAF scaffold. Since no high-resolution X-ray structure was available to establish catalytic activity on HisAF by a rational design approach, a directed evolution strategy was chosen. Since PRA-isomerase (TrpF) activity could be established earlier on the parental proteins HisA and HisF, an attempt was made to establish TrpF activity also on the HisAF scaffold. For this purpose, cells of a trpF deletion strain (deltatrpF) were transformed with a hisAF gene library, which was generated by error prone PCR. Active variants were selected by in vivo complementation in solid and liquid minimal media lacking tryptophan. Four of the complementing HisAF-variants, which carried 1�5 amino acid exchanges, were expressed, purified, and characterized in vitro. Although the recombinant protein variants showed only weak TrpF activity (kcat/KMPRA = 0.1�6.8 mM-1min-1), the catalytic efficiency was consecutively increased by several orders of magnitude by the combination of bona fide beneficial exchanges. The most active variant HisAFcomIII, which contained seven amino acid exchanges in total, shows a catalytic efficiency for the PRA substrate of 1425 mM-1min-1. While its turnover number (kcat = 4 min-1) is about 50-fold lower than that of wild-type TrpF enzymes, the corresponding values for the Michaelis constant (KMPRA = 2.9 µM) and the dissociation constant for binding a product analog (KdrCdRP = 5.6 µM) are comparable to the corresponding values for E. coli TrpF. The construction of further gene libraries on the basis of HisAFcomIII gave raise to the isolation of faster complementing variants which, however, showed only slightly increased TrpF activity in vitro. Presumably, the apparent increase of catalytic activity in vivo is caused by an increased conformational stability of these proteins.
Moreover, amino acid exchanges which were identified in the selection for TrpF activity of HisAF, were transferred into the parental proteins HisA and HisF. The prior identified weak TrpF activity of HisF-D130V was only slightly increased by the introduction of new mutations, whereas the additional exchange D169V in the earlier characterized variant HisA-H75Y+F111S+D127V yielded to a significant increase in catalytic efficiency (kcat/KMPRA = 4335 mM-1min-1). Noteworthy, the turnover number (kcat = 67 min-1) of this HisA variant reaches about 30 % of the turnover number of T. maritima TrpF and is higher than the turnover number of wild-type HisA for its native reaction. In cooperation with Dr. Birte Höcker, HisA-H75Y+F111S+D127V was crystallized and its X-ray structure was solved at a resolution of 1.8 Å. Currently PRA is modeled into the active site of the enzyme to elucidate the mechanistic basis for the high TrpF activity.
In concert, the results of this thesis support the hypothesis that in the course of the evolution of (beta/alpha)8-barrel enzymes recombination of (beta/alpha)4 half-barrels took place. Additionally, these results confirm once more that the (beta/alpha)8 protein scaffold is particularly suitable for enzyme design.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 11:19
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