| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (20MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-11863
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12244
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 0 April 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Jörg (Prof. Dr.) Heilmann |
| Tag der Prüfung: | 4 März 2009 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie (Prof. Heilmann) |
| Stichwörter / Keywords: | Angeborene Immunität , Rekombinantes Protein , Sepsis , Toll-like-Rezeptoren , Immunreaktion , Lipopolysaccharide , Lipopolysaccharid , Fusionsprotein , innate immunity , Toll-like receptors , sepsis , recombinant protein , lipopolysaccharid , fusion protein |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12244 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die bakterielle Sepsis ist trotz intensiver Forschung immer noch eine der Haupttodesursachen auf Intensivstationen. Im Verlauf einer Sepsis kommt es durch eine Überflutung mit mikrobiellen Produkten zu einer generalisierten Entzündungsreaktion, die sich gegen den eigenen Organismus richtet. Die Toll-like Rezeptoren (TLR) 4 als Sensor für Lipopolysaccharide (LPS) und TLR2 als Rezeptor für ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die bakterielle Sepsis ist trotz intensiver Forschung immer noch eine der Haupttodesursachen auf Intensivstationen. Im Verlauf einer Sepsis kommt es durch eine Überflutung mit mikrobiellen Produkten zu einer generalisierten Entzündungsreaktion, die sich gegen den eigenen Organismus richtet. Die Toll-like Rezeptoren (TLR) 4 als Sensor für Lipopolysaccharide (LPS) und TLR2 als Rezeptor für Lipopeptide spielen eine Schlüsselrolle in der Auslösung dieser Überreaktion. Mit der Absicht die Antwort auf das gesamte Ligandenspektrum von TLR4 und TLR2 zu modulieren, wurden lösliche TLR-Fusionsproteine konstruiert.
In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass sich eine LPS-induzierte Entzündungsreaktion sowohl in vitro als auch in vivo durch lösliche TLR4/myeloid differentiation-2 (MD-2)-Fusionsproteine (LPS-Trap-His) hemmen ließ. Um das Potential der LPS-Trap zu erweitern, wurde das C-terminale His-Peptid durch ein humanes IgG-Fc-Fragment (hIgG-Fc) ersetzt (LPS-Trap-Fc). Das Fc-Fragment sollte zu erleichterter Isolierung, zu längeren Serumhalbwertszeiten und zu biologischen Sekundäreffekten führen.
Die LPS-Trap-Fc war in der Lage, LPS zu binden und den für die effektive Bindung von LPS essentiellen TLR4/MD-2 Komplex zu bilden. Weiterhin konnte durch das Fusionsprotein eine LPS-induzierte proinflammatorische Reaktion in MonoMac 6-Zellen effektiv gehemmt werden. Das Potential universell TLR4-Liganden zu binden, konnte mit weiteren Liganden für TLR4 bestätigt werden. Die direkte Bindung und Hemmung von Paclitaxel bestätigte die mit membranständigem TLR4/MD2 vergleichbaren Bindungseigenschaften des Fusionsproteins. Darüberhinaus band die LPS-Trap direkt High mobility group box 1 (HMGB1), das während einer Sepsis als Spätmediator zum Entzündungsgeschehen beiträgt.
In Bindungsstudien konnte nachgewiesen werden, dass die LPS-Trap-Fc spezifisch über MD-2 an die Oberflächen Gram-negativer Bakterien bindet und somit antikörperähnliches Potential besitzt. Mit verschiedenen Isotypvarianten der LPS-Trap-Fc war es möglich, die Phagozytose von Escherichia. coli�Partikeln und die Komplementaktivität gegen lebende E. coli zu modulieren. Das IgG-Fc Fragment entwickelte folglich biologische Aktivität und führte zu Sekundäreffekten.
Die Optimierung des Fusionsproteins in Hinsicht auf Ausbeuten und Wirkung stellte ein weiteres Ziel dar. Mit den verkleinerten Varianten LPS-Trap-FcM und -FcS konnten deutlich höhere Ausbeuten erzielt werden. In weiteren Untersuchungen stellte sich aber heraus, dass die LPS-Trap-FcM und �FcS trotz nachgewiesener Bindung von LPS den TLR4/MD-2 Komplex nicht mehr bildeten und demzufolge in vitro keine Hemmwirkung gegen LPS entwickelten. Ferner führten Modifikationen am Linker-Polypeptid zwischen TLR4 und MD-2 zu keiner wesentlichen Verbesserung der LPS-Bindung.
Da über Protein G gereinigte LPS-Trap-Fc aufgrund von Oligomerenbildung biologisch inaktiv war, wurde für den Einsatz im Tiermodell ein LPS-Trap-Fc produzierendes Adenovirus (Ad-LPS-Trap-Fc) verwendet. Die Fusionsproteinkonzentration im Mausserum verringerte sich innerhalb kürzester Zeit ungewöhnlich schnell, was sowohl auf einen schnellen Abbau als auch eine inadäquate Produktion des Fusionsproteins hinwies. Eine LPS-Stimulation von Ad-LPS-Trap-Fc infizierten CD-1 Mäusen führte überraschenderweise zu erhöhten Zytokinspiegeln gegenüber kontrollinfizierten Tieren. Weitere Untersuchungen mit konventionell hergestellten Fusionsproteinen sollen die widersprüchlichen in vivo-Daten der LPS-Trap-His und �Fc klären.
Um eine komplette Abdeckung von exogenen und endogenen Stimulatoren in Kombination mit der LPS-Trap zu erreichen, wurden TLR2/TLR1- (T2/1-Fc) und TLR2/TLR6- (T2/6-Fc) hIgG-Fc Fusionsproteine konstruiert. Durch diese sollte eine gezielte Hemmung von diacylierten (T2/6-Fc) und triacylierten (T2/1-Fc) Lipopeptiden Gram-positiver Bakterien erreicht werden. Beide Fusionsproteine waren in der Lage an LTA-beschichtete Platten zu binden. Die Hemmung einer Pam2CSK4 und einer Pam3CSK4 stimulierten Entzündungsreaktion konnte unabhängig vom verwendeten Fusionsprotein erzielt werden. Das Prinzip der Hemmung durch lösliche Rezeptoren ist demzufolge auch auf TLR2 übertragbar.
TLR-Fusionsproteine besitzen somit das grundsätzliche Potential, proinflammatorische Reaktionen zu modulieren. Zusätzlich zur Neutralisierung von TLR4-Liganden entwickelt die LPS-Trap multifunktionale Aktivität durch die Förderung von Phagozytose und Komplementaktivierung. Die Natur der in vivo Wirkung muss zukünftig in weiteren Versuchen mit konventionell hergestellten Proteinen genauer charakterisiert werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Though extensive research sepsis remains one of the leading death causes in intensive care units. The high rate of mortality results from an inappropriately amplified systemic inflammatory response to infection. Toll like receptor (TLR) 4/myeloid differentiation-2 (MD-2) as sensor for lipopolysaccharids (LPS) and TLR2 as receptor for lipopeptides play a key role in triggering this overwhelming ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Though extensive research sepsis remains one of the leading death causes in intensive care units. The high rate of mortality results from an inappropriately amplified systemic inflammatory response to infection. Toll like receptor (TLR) 4/myeloid differentiation-2 (MD-2) as sensor for lipopolysaccharids (LPS) and TLR2 as receptor for lipopeptides play a key role in triggering this overwhelming inflammation. With intention to modulate the TLR-response towards the whole ligand spectrum TLR4/MD-2 and TLR2 fusion proteins were constructed and tested for the inhibitory efficacy.
In preliminary studies a TLR4/MD-2 fusion protein (LPS-Trap-His) was capable to inhibit proinflammatory reactions in vitro and in vivo. In order to expand the potential of the LPS-Trap the C-terminal His-peptid was replaced by a human IgG-Fc (LPS-Trap-Fc). The Fc-Fragment should convey to simplified purification, prolonged half-time in vivo and secondary biological effects.
The LPS-Trap-Fc was capable to bind LPS and to form the native TLR4/MD-2 complex which is essential for effective binding of LPS. A LPS-induced proinflammatory reaction in MonoMac6 cells could actively modulated by the LPS-Trap-Fc. The supposed advantage of the LPS-Trap-Fc versus exclusive antiendotoxin strategies is the capability to bind the whole ligand spectrum of TLR4. The comparable binding efficacy versus membrane TLR4/MD-2 was affirmed by direct binding and inhibiting biological responses of the taxane Paclitaxel. Further High mobility group box 1 (HMGB1), which is a late mediator of inflammation in the course of sepsis, was directly bound by the LPS-Trap.
In binding studies we could show the specific binding of the LPS-Trap-Fc via its MD-2 to the surface of Gram-negative bacteria and therefore acts like an antibody. The different IgG-Fc isotype variants of the LPS-Trap-Fc were capable of modulating the phagocytosis of Escherichia coli particles and complement activity versus living E. coli. Therefore we could show the multifunctional properties of the fusion protein.
In order to optimize the designed protein with regard to production yield and activity we constructed shortened variants of the fusion protein (LPS-Trap-FcM and LPS-Trap-FcS). Although higher production yields were achieved and LPS was bound by the LPS-Trap-FcM and �FcS, they were not capable to form the TLR4/MD-2 complex and therefore showed no inhibiting activity in vitro. Further modifications on the linker-polypeptid between TLR4 and MD-2 did not lead to substantial improvement of LPS binding.
As purification of the LPS-Trap-Fc through Protein G affinity chromatography leads to oligomers and biological inactivity, an adenoviral vector (Ad-LPS-Trap-Fc) was used for in vivo experiments. The fusion protein concentration in mouse sera showed a rapid decrease, which indicates inappropriate production as well as rapid degradation of the LPS-Trap-Fc. Surprisingly LPS challenge of Ad-LPS-Trap-Fc infected CD-1 mice drives higher proinflammatory cytokine levels in sera than in control-infected mice. Further investigations with conventional produced LPS-Trap-Fc shall provide deeper insights of the in vivo activity.
With intent to gain an extended modulation of exogen and endogen mediators of inflammation, TLR2/TLR1 and TLR2/TLR6 human IgG-Fc fusion proteins (T2/1-Fc and T2/6-Fc) were constructed. Both fusion proteins were capable of binding to lipoteichoic acid coated microwells. The inhibition of a Pam2CSK4 and a Pam3CSK4 was achieved independently of the acylation status. Hence the principle of inhibition by soluble TLR fusion proteins is transferable to TLR2.
All together TLR fusion proteins possess at least in vivo the potential of inhibiting inflammatory reactions. In addition to its neutralizing capability the LPS-Trap-Fc develops multifunctional activity as modulation of phagocytosis and complement. The nature of the in vivo activity of TLR-fusion proteins has to be revealed prospectively with conventional produced proteins.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 11:10
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