| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (1MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-12365
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12268
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 17 Mai 2009 |
Begutachter (Erstgutachter): | Ralph (Prof. Dr.) Witzgall |
Tag der Prüfung: | 11 März 2009 |
Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie > Prof. Dr. Ralph Witzgall |
Stichwörter / Keywords: | Tumorimmunologie , Angiogenese , Antikörper , Tumor-Nekrose-Faktor , Rezeptor , Stimulaton , Tumorwachstum , Interleukin 8 , Genexpression , Lymphotoxin beta Rezeptor , MIP-2 , Interleukin-8 , NFkappaB , lymphotoxin beta receptor , MIP-2 , interleukin-8 , nfkappab |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 12268 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Der Lymphotoxin beta Rezeptor (LTbetaR), ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie, interagiert funktionell sowohl mit dem auf aktivierten B-, T- und NK-Zellen exprimierten Liganden LTalpha1beta2 als auch mit LIGHT. Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass die Stimulierung des LTbetaR auf Maus-Fibrosarkomzellen (BFS-1) zu einer NFkB-Aktivierung und zur erhöhten Expression von proangiogenem MIP-2 führt. ...
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Zusammenfassung (Deutsch)
Der Lymphotoxin beta Rezeptor (LTbetaR), ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie, interagiert funktionell sowohl mit dem auf aktivierten B-, T- und NK-Zellen exprimierten Liganden LTalpha1beta2 als auch mit LIGHT. Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass die Stimulierung des LTbetaR auf Maus-Fibrosarkomzellen (BFS-1) zu einer NFkB-Aktivierung und zur erhöhten Expression von proangiogenem MIP-2 führt. Dadurch kommt es zu einer erhöhten Angiogenese und zu einem verstärkten Tumorwachstum in vivo.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die molekularen Mechanismen zwischen der Aktivierung des LTbetaR, der Induktion von proangiogenem MIP-2 und dem verstärkten Tumorwachstum in einem syngenen Tumormodell der Maus untersucht. Dazu wurde zunächst versucht, die LTbetaR Expression auf den Maus-Fibrosarkomzellen mittels short hairpin-(sh)-RNA herunter zu regulieren. Durch eine stabile Transfektion der Fibrosarkomzellen mit einem spezifischen, gegen den mLTbetaR gerichteten shRNA-Vektor konnte die LTbetaR-Expression auf 15 % der Zellen verringert werden. Nach der Stimulierung des LTbetaR auf den transfizierten Fibrosarkomzellen konnte jedoch keine Verminderung der NFkB-Aktivierung und der Expression von proangiogenem MIP-2 nachgewiesen werden.
Weiterhin wurde untersucht, welcher der beiden NFkB-Signalwege in den Fibrosarkomzellen nach der Stimulierung des LTbetaR bei der Induktion von proangiogenem MIP-2 aktiviert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass nach LTbetaR-Stimulierung sowohl der klassische als auch der alternative NFkB-Signalweg in den Fibrosarkomzellen aktiviert wird. Nach der stabilen Transfektion der Fibrosarkomzellen mit spezifischen NFkB-Inhibitoren, die den klassischen NFkB-Weg (IkBalpha Superrepressor) oder den alternativen NFkB-Weg (dominant-negative Form von NIK oder NIK DN) hemmen, wurde die MIP-2-Expression in Abhängigkeit der beiden Signalwege untersucht. Die mit den NFkB-Inhibitoren transfizierten Fibrosarkomzellen exprimieren stark verminderte Mengen an proangiogenem MIP-2, zeigen eine Beeinträchtigung bei der Rekrutierung der NFkB-Proteine Rel A, Rel B, p50 und p52 und zeichnen sich auf syngenen C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu Kontrollzellen durch ein stark verringertes Tumorwachstum aus. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass bereits die Hemmung eines der beiden NFkB-Signalwege ausreicht, damit das Tumorwachtsum in vivo vermindert ist.
Die im BFS-1-Tumormodell der Maus erhaltenen Ergebnisse bezüglich der LTbetaR-Expression und -Aktivierung wurden an humanem Biopsiematerial sowie an entsprechenden humanen Tumorzelllinien überprüft.
Dazu wurden zunächst Antikörper gegen den huLTbetaR mit Hilfe der Hybridomtechnik hergestellt. Nach der Expression der rekombinanten extrazellulären Domäne des huLTbetaR in E.coli und der Immunisierung von Balb/c-Mäusen konnten drei monoklonale Antikörper produzierende Hybridome (4D6, 8A8 und 13H6) stabil etabliert werden. 4D6 kann im Dot Blot und 8A8 im Western Blot zum Nachweis des LTbetaR verwendet werden. Außerdem besitzt der Klon 8A8 antagonistische Wirkung. Für die Analyse von Zellen im Durchflusszytometer ist der Hybridomklon 13H6 geeignet. Jedoch zeigte keiner der anti-huLTbetaR monoklonalen Antikörper eine agonistische Wirkung in Bezug auf die Aktivierung des NFkB-Signalwegs oder die Induktion von proangiogenem IL-8, welches im humanen System das funktionelle Homolog zum MIP-2 in der Maus darstellt.
Die Expression des LTbetaR in primären humanen Tumorgeweben, wie Kolon- und Ovarialkarzinomen, konnte mit Hilfe eines anti-huLTbetaR monoklonalen Antikörpers (Klon 3G10H3) nachgewiesen werden. In Stimulierungsexperimenten, die mit primärem postoperativen Kolon- und Ovarialkarzinomgeweben durchgeführt wurden, konnte weder mit Hilfe der quantitativen PCR noch mittels ELISA eindeutig eine Induktion der IL-8 Expression nach LTbetaR-Stimulierung beobachtet werden. Aus diesem Grund wurden für weitere Stimulierungsexperimente humane Kolon- und Ovarialkarzinomzelllinien verwendet. Dabei zeigte sich, dass die IL-8-Expression in zwei der sechs untersuchten Kolonkarzinomzelllinien (HCT 116 und LoVo) und in drei der vier getesteten Ovarialkarzinomzelllinien (SK-OV-3, OVCAR-3 und Caov-3) durch die Stimulierung mit LIGHT induzierbar ist. In jeweils einer Kolon- (LoVo) und einer Ovarialkarzinomzelllinie (Caov-3) konnte durch Stimulierung mit agonistischem anti-huLTbetaR Antikörper eine IL-8-Expression induziert werden. Durch die Hemmung des klassischen (IkBalpha Superrepressor) oder des alternativen (NIK DN) NFkB-Signalwegs konnte zudem eine Verringerung der IL-8-Expression nachgewiesen werden. Damit konnte gezeigt werden, dass es nach der Stimulierung des LTbetaR zu einer Aktivierung beider NFkB-Signalwege kommt, die für eine induzierte IL-8-Expression in den untersuchten humanen Kolon- und Ovarialkarzinomzelllinien verantwortlich sind.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The lymphotoxin beta receptor (LTbetaR), a member of the TNF receptor superfamily, has two different ligands: LTalpha1beta2 which is expressed on activated B, T and NK cells and LIGHT. Previous work has shown that the stimulation of LTbetaR on mouse fibrosarcoma cells (BFS-1) leads to an activation of NFkB and to an enhanced expression of proangiogenic MIP-2. This results in increased ...
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Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The lymphotoxin beta receptor (LTbetaR), a member of the TNF receptor superfamily, has two different ligands: LTalpha1beta2 which is expressed on activated B, T and NK cells and LIGHT. Previous work has shown that the stimulation of LTbetaR on mouse fibrosarcoma cells (BFS-1) leads to an activation of NFkB and to an enhanced expression of proangiogenic MIP-2. This results in increased angiogenesis and enhanced tumor growth in vivo.
Within this dissertation, the molecular mechanisms between the activation of the LTbetaR, the induction of proangiogenic MIP-2 and the enhanced tumor growth were analyzed in a syngeneic mouse tumor model. First, an experiment was designed in which the LTbetaR expression on mouse fibrosarcoma cells should be decreased via short-hairpin (sh) RNA. Using a specific designed shRNA vector which was stable transfected into fibrosarcoma cells, the expression of the LTbetaR could be reduced by 15 %. However, after stimulation of the LTbetaR on the transfected fibrosarcoma cells there was neither a reduced NFkB-activation nor a decreased expression of proangiogenic MIP-2 detectable.
Furthermore, it was analyzed which NFkB signaling pathway is activated in the fibrosarcoma cells after stimulation of LTbetaR and induction of proangiogenic MIP-2. The results show that after LTbetaR stimulation both NFkB signaling pathways (classical and alternative) are activated in fibrosarcoma cells. Then, fibrosarcoma cells were stable transfected with specific inhibitors of NFkB proteins which block either the classical pathway (IkBalpha superrepressor) or the alternative pathway (dominant-negative mutant of NIK or NIK DN). Afterwards, the MIP-2 expression was analyzed. All transfected fibrosarcoma cell lines expressed highly reduced amounts of proangiogenic MIP-2, were impaired in the recruitment of the NFkB proteins Rel A, Rel B, p50 and p52 and showed a decreased tumor growth on syngeneic C57BL/6 mice compared to control cells. Therefore, we were able to show that the blockade of one of the two NFkB signaling pathways is already sufficient to reduce tumor growth in vivo.
The results of these BFS-1 tumor model experiments in the mouse were then verified in the human system. The expression and activation of the LTbetaR was analyzed using human biopsies of different tumors and human tumor cell lines.
First of all, antibodies against the human LTbetaR were generated using hybridoma thechnique. After recombinant expression of the extracellular domain of the human LTbetaR in E.coli, we immunized Balb/c mice and generated three different monoclonal antibodies (4D6, 8A8 and 13H6) specific for human LTbetaR. 4D6 can be used for Dot Blot and 8A8 show a positive signal in Western Blot. Furthermore, 8A8 seems to have an antagonistic effect. 13H6 can be used for the analysis of cells in flow cytometry. None of the monoclonal anti-huLTbetaR antibodies have agonistic activity concerning activation of the NFkB signaling pathway or induction of proangiogenic IL-8 which is the human functional homologue to mouse MIP-2.
Expression of the LTbetaR in primary human tumor tissues like colon and ovarian carcinomas was analyzed. Stimulation of LTbetaR in these primary post-operative colon or ovarian carcinoma tissues did not have an effect on the induction of IL-8. For this reason, human colon and ovarian carcinoma cell lines were used for further stimulation experiments. In these experiments, it could be shown that the expression of IL-8 is inducible with recombinant human LIGHT in two of six tested colon carcinoma cell lines (HCT 116 and LoVo) and in three of four tested ovarian carcinoma cell lines (SK-OV-3, OVCAR-3 and Caov-3). In one colon carcinoma cell line (LoVo) and in one ovarian carcinoma cell line (Caov-3) the stimulation of the LTbetaR with an agonistic anti-huLTbetaR antibody lead also to an induction of IL-8. Furthermore, the blockade of the classical (IkBalpha superrepressor) or the alternative (NIK DN) NFkB signaling pathway resulted in a reduced expression of IL-8. Therefore in conclusion, the stimulation of the LTbetaR leads to an activation of both NFkB signaling pathways which are responsible for the induction of IL-8 expression in the analyzed human colon and ovarian carcinoma cell lines.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 11:06