Isolierung und Optimierung antimikrobiell wirkender Phagenproteine zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Staphylokokken

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-opus-13437
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.12332

Forchheim, Michael

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Date of publication of this fulltext: 15 Sep 2009 14:09

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	14 September 2009
Referee:	Reinhard (Prof. Dr.) Sterner
Date of exam:	28 April 2009
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner
Keywords:	MRSA , Lyse <Biologie> , Proteinfaltung , Staphylococcus aureus , Antimikrobieller Wirkstoff , Bakteriophagen , Endolysine , Proteindesign , Endolysine , Zelllyse , topisch , systemisch , domainshuffling , antimicrobial , phage , protein
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	12332

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Abstract (German)

Abstract (German)

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung eines neuen, gereinigten
funktionellen Bakteriophagenproteins zur systemischen und topischen Anwendung
gegen Infektionen mit Staphylococcus aureus.
Nach der Isolation lytischer Bakteriophagen gegen Staphylococcus aureus aus
Umweltproben wurde das Wirtsspektrum der Phagen untersucht. Aus dem Genom
der isolierten Phagen mit einem geeigneten Wirtsspektrum wurden durch
Homologiesuche potentielle Endolysinsequenzen identifiziert. Die Endolysine wurden rekombinant in Escherichia coli exprimiert. Anschließend erfolgte die Untersuchung der Lyseaktivität, der Löslichkeit, der Stabilität und der Spezifität der Proteine. Da alle isolierten Proteine unlöslich in inclusion bodies exprimiert werden, wurden Methoden zur Solubilisierung, Rückfaltung und Funktionstestung etabliert und optimiert. Das isolierte Wildtyp-Endolysin Pitti26Ami zeigte in Puffer lytische Aktivität gegen Staphylococcus aureus. In humanem Serum konnte keine Lyseaktivität detektiert werden. Zur Minimierung der Aktivitätshemmung in Serum wurde ein gezielter intermolekularer Austausch einzelner Domänen verschiedener Kandidatenproteine genutzt. Durch Austausch der CBD von Pitti26Ami gegen die aus Plyusa300, eines Prophagen-Endolysins aus Staphylococcus aureus USA 300 MLST type 8, wurde das Kandidatenprotein K9 erzeugt. Mit diesem Enzym konnte Zelllyseaktivität auch in humanem Serum festgestellt werden. Nach Entfernung von oberflächenexponierten Aromaten, hydrophoben Aminosäuren und Protease-Erkennungssequenzen entstand das Kandidatenprotein K10. Dieses Protein wurde in vitro hinsichtlich Stabilität und Lyseaktivität charakterisiert. Die Aktivitätssteigerung in K9 und K10
wurde auf Kosten einer, um 6°C gesunkenen Thermosta bilität erreicht. Die CBD
erwies sich dabei als die instabilste Domäne. Weiterhin konnte nachgewiesen
werden, dass der Großteil der hydrolytischen Aktivität in der CHAP-Domäne
lokalisiert ist. In den nachfolgenden in vivo Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass K10 weder in Zellkultur, noch im Säuger toxisch wirkt. Durch polyklonale Antikörper konnte die Aktivität des Proteins in vitro neutralisiert werden. Bei in vivo Untersuchungen in Mäusen konnte eine Neutralisation durch Immunserum i.p. immunisierter Tiere festgestellt werden. Serum i.v. immunisierter Tiere zeigte keine Tendenz zur Neutralisation von K10. Pharmakokinetische Untersuchungen in Ratten und Western Blot Analysen ergaben eine Halbwertszeit des Proteins von 50 min. Ein Abbau des Wirkstoffs in Organen erfolgte nur in der Niere. Schließlich konnte eine Reduktion der Zellzahl im Blut und im Herzgewebe von Ratten, um den Faktor 3, festgestellt werden. Dies reichte in einem Tiermodell für eine Überlebensrate von 100% aus. In einem �härteren� Modell konnte die Wirkung jedoch nicht bestätigt werden. Aus Lysetests in verschiedenen Sera ging hervor, dass die hydrolytische Aktivität von K10 in Ratten- und Mäuseserum, im Gegensatz zum Einsatz in humanem Serum sehr stark gehemmt wird. Durch Einsatz der CBD aus dem Bacteriocin Lysostaphin konnte eine Stabilisierung des Proteins um 6°C gegenüber K10 erreicht werden. Die schnellere Zelllyse in Serum erwies sich jedoch als unvollständig, weshalb nach einer anderen EAD gesucht wurde. Durch Fusionierung einer N-terminalen CHAP-Domäne aus einem Prophagen des Stammes Staphylococcus aureus USA 300 MLST type 8 mit der CBD von Lysostaphin am C-Terminus wurde das Protein K12 erzeugt. Dieses zeigte eine Thermostabilität, welche mit der von K10 vergleichbar ist. K12 erwies sich als das Protein mit der höchsten bakteriziden Aktivität in Ratten-, Maus-, und humanem Serum. Die zusätzliche Insertion einer zentralen Amidase zwischen die beiden Domänen von K12 hatte keine Verbesserung der Eigenschaften zur Folge. K12 kristallisierte sich als vielversprechendster Kandidat für eine systemische Anwendung heraus, allerdings ist die Bestätigung der in vitro Ergebnisse durch in vivo Untersuchungen nötig.
Da, neben der systemischen Anwendung des Enzyms auch der Einsatz zur
Dekolonisierung, bzw. als topisch einsetzbares Therapeutikum geplant war, wurden
Zelllysetests in Mucin durchgeführt. Hierbei zeigten die Kandidaten K10 und K12
Zelllyseaktivität von Staphylococcus aureus Zellen der exponentiellen
Wachstumsphase. Mit K12 war, im Gegensatz zu K10 auch die effektive Lyse
stationärer Zellen in Mucin möglich. K12 erwies sich als das Protein, mit der
effektivsten Lyseaktivität stationärer Zellen. Aus diesen Versuchen ging K12 als
bestgeeignetster Kandidat hervor.
Bei der Entwicklung eines antibakteriellen Therapeutikums müssen diverse Faktoren, wie Funktionalität in der Anwendungsumgebung, Stabilität des Proteins, Selektivität, Toxizität und Immunogenität beachtet werden. Prinzipiell wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Phagenproteine nach einer gezielten Optimierung als antibakterielle Therapeutika zur selektiven Bekämpfung gram-positiver Erreger, wie z.B. Staphylococcus aureus, einsetzbar sind.

Translation of the abstract (English)

Aim of this thesis was the production of a novel, purified and functional bacteriophage protein for systemic and topical use against infections with Staphylococcus aureus.
Lytic bacteriophages were isolated from their host Staphylococcus aureus and the lytical spectrum was determined. Endolysin coding sequences were identified by homolgy search. After recombinant expression of target proteins in E. coli, proteins were characterized in therms of lytic activity, solubility, stability and specificity. Due to the expression of target proteins in inclusion bodies, methods for solubilization, refolding and functional testing had to be established.
The wiltype protein $\\\"$ Pitti26Ami $\\\"$ showed lytic activity in buffer but not in serum. An intermolecular exchange of domains from different candidate proteins was performed to decrease this inhibition of activity. By introduction of the CBD of Plyusa300 (Endolysin derived from lysogen bacteriophage) the candidate protein K9 was build. K9 showed lytic activity in human serum as well. K9 was further optimized by elimination of surface exposed aromatic amino acids, hydrophobic amino acids and target sequences for proteases. The resulting candidate K10 showed an increased activity but thermostability decreased by 6°C. The CBD was the domain with the lowest thermostability. The main activity of the protein was localized within the CHAP domain. In vivo experiments showed no toxicity of K10. Activity was neutralized by antibodies in vitro. Activity of K10 was also neutralized by serum of i.p. immunized mice but not by serum of i.v. immunized mice. Pharmacokinetic analyses in rat and western blot analyses resulted in a half life of K10 of 50 min. Degradation of the protein occured in the kidney. A threefold cell count reduction in blood and heart tissue was detected. Tests of lytic activity showed a stronger inhibition of K10 in sera derived from rat or mice compared to human serum. By replacing the CBD of K10 by the CBD of Lysostaphin, K10 was stabilized by 6°C. Due to the incomplete cell lysis another EAD was necessary. K12 was constructed by fusion of the N-terminal CHAP domain of a lysogen phage (derived from Staphylococcus aureus usa 300 MLST type 8) with the CBD of Lysostaphin at the C-terminal end. K12 showed the best activity in all kinds of serum. An insertion of an Amidase domain between CHAP and CBD didn´t increase protein properties. K12 is the most promising candidate for a systemic application. In vitro results for K12 have to be validated by in vivo experiments.
For topical applications lysis in mucin was tested. Again K12 showed the best activity of the candidate proteins.
An potential antibacterial therapeutic agent has to be functional in the place of action. Stability, selectivity, toxicity and immunogenicity of the agent have to be known.
This thesis shows the ability of optimized phage proteins to fight gram-positive pathogens like Staphylococcus aureus selectively. Therefore phage proteins are a promising opportunity as antimicrobial therapeutic agents.