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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-130088
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.13008
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 9 März 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Armin Buschauer und Prof. Dr. Günther Bernhardt |
| Tag der Prüfung: | 16 Februar 2010 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische / Medizinische Chemie II (Prof. Buschauer) |
| Stichwörter / Keywords: | glioblastoma, nanoparticles, ABCG2, optical imaging, xenografts Glioblastom, Nanopartikel, ABCG2, Optisches Imaging, Xenotransplantate |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 13008 |
Zusammenfassung (Englisch)
The treatment of malignant brain tumors, especially of high-grade gliomas, poses one of the major challenges in cancer therapy. Despite seminal advancements in imaging techniques for the early diagnosis of CNS neoplasms as well as amendments in surgery and radiooncology, the prognosis of patients with glioma is very poor. The administration of temozolomide adjuvant to irradiation after resection ...
Zusammenfassung (Englisch)
The treatment of malignant brain tumors, especially of high-grade gliomas, poses one of the major challenges in cancer therapy. Despite seminal advancements in imaging techniques for the early diagnosis of CNS neoplasms as well as amendments in surgery and radiooncology, the prognosis of patients with glioma is very poor. The administration of temozolomide adjuvant to irradiation after resection of the tumor - the current “gold standard” in the treatment of glioblastoma - has only marginally improved median survival by ca. 3 months. Hence, there is an urgent need for novel approaches to the treatment of malignant brain tumors. To investigate the efficiency of such regimens in vivo, predictive preclinical animal models are indispensible.
In this thesis, three subject areas were dealt with:
- evaluation of doxorubicin-loaded poly(butylcyanoacrylate) (PBCA) nanoparticle (NP) formulations as drug-carriers,
- modulation of the ATP-binding cassette transporter ABCG2, which is expressed in brain capillaries, by newly synthesized inhibitors, as a strategy to overcome the blood-brain barrier (BBB) with chemotherapeutics, which are substrates of this efflux pump, and
- refinement of orthotopic glioblastoma models in nude mice to allow noninvasive optical imaging of intracerebral tumors.
Human glioblastoma cells U-87 MG, U-118 MG and U-373 MG were incubated with free doxorubicin and doxorubicin loaded onto PBCA NPs. As the glioblastoma cells do neither express ABCB1 nor ABCG2, Kb-V1 and MCF-7/Topo cells were included, to study effects on both efflux pumps. In the crystal-violet chemosensitivity assay, cytotoxicities of the doxorubicin-loaded NPs and of the dissolved cytostatic were similar against all glioblastoma cells. By contrast, a higher efficacy of the NP formulations was observed on ABCB1-overexpressing Kb-V1, but not on ABCG2-expressing MCF-7/Topo cells, indicating an interaction of the NPs with the ABCB1 efflux pump. Therefore, increased drug concentrations in the brain after administration of such drug-loaded NPs to animals, as reported in literature, might be due interactions of the NPs with ABCB1 at the BBB.
The modulation of ABC transporters at the BBB represents an attractive strategy to increase intracerebral levels of drugs, which are known to be substrates of such efflux pumps.
For this reason, the identification of potent efflux pump inhibitors is a promising approach to improve the chemotherapy of brain tumors. A series of analogs, derived from the original ABCB1 inhibitor tariquidar, was investigated for potency against ABCG2 and selectivity vs. ABCB1. To expand methodology and to by-pass problems associated with the flow cytometric (FACS) mitoxantrone-efflux assay, two 96-well plate assays, using the fluorescent ABCG2 substrates Hoechst 33342 and pheophorbide a, were developed. Interestingly, slight structural modifications of tariquidar analogs yielded potent and selective inhibitors of ABCG2. The most potent modulator showed an IC50 value of 60 nM in the FACS assay and 65 and 126 nM in the microtiter plate assays. In view of future in vivo studies, the most potent inhibitors were investigated for stability in plasma by the means of HPLC-MS analysis. Unfortunately, these compounds are prone to rapid enzymatic cleavage at the central benzamide moiety. Therefore, compounds with improved drug-like properties are required. Since a regulation of ABCG2 by estrogens is discussed in literature, MCF-7/Topo cells were treated with estradiol and subjected to treatment with topotecan. No differences in the antiproliferative effect between estradiol-treated and non-treated controls were observed, indicating, at best, a therapeutically irrelevant regulation of the ABCG2-level by estradiol.
To investigate the therapeutic value of new concepts, e.g. the combined administration of selective inhibitors of ABC-transporters with appropriate cytostatics, the main focus of this work was the refinement of in vivo xenograft models. Indeed, orthotopic brain tumor models, allowing the monitoring of tumor progression by noninvasive optical imaging, were established in nude mice. For this purpose, human U-87 MG glioblastoma cells were transfected with the genes encoding luciferase2 (Luc2) and the recently discovered far-red fluorescent protein Katushka (Kat), respectively. Numerous clones were characterized in vitro with respect to bioluminescence / fluorescence, growth kinetics and chemosensitivity. As the transfectants were tumorigenic subcutaneously (s.c.), and Luc2 as well as Kat expression persisted in the s.c. model, the human glioblastoma variants were injected into the brains of nude mice, where reproducibly growing tumors developed. Most important is the fact that these intracerebral xenografts were accessible to both, bioluminescence and fluorescence imaging. Moreover, there was a direct correlation between the optical signals and the tumor load, confirmed by histology.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Behandlung maligner Hirntumoren, insbesondere hochgradiger Gliome, ist eine der größten Herausforderungen der Krebstherapie. Trotz erheblicher Weiterentwicklung der Bildgebungsverfahren zur frühen Diagnose von ZNS Tumoren und Verbesserungen chirurgischer sowie insbesondere strahlentherapeutischer Techniken ist die Prognose betroffener Patienten äußerst schlecht. Mit Temozolomid als Adjuvans ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Behandlung maligner Hirntumoren, insbesondere hochgradiger Gliome, ist eine der größten Herausforderungen der Krebstherapie. Trotz erheblicher Weiterentwicklung der Bildgebungsverfahren zur frühen Diagnose von ZNS Tumoren und Verbesserungen chirurgischer sowie insbesondere strahlentherapeutischer Techniken ist die Prognose betroffener Patienten äußerst schlecht. Mit Temozolomid als Adjuvans zur Strahlentherapie nach möglichst radikaler Tumorresektion - der Status quo bei der Behandlung von Glioblastomen - hat sich die Überlebenszeit mit ca. 3 Monaten nur geringfügig verlängert. Deshalb besteht dringender Bedarf an neuen Ansätzen zur Behandlung maligner Hirntumoren. Außerdem sind prädiktive präklinische Tiermodelle unabdingbare Voraussetzung für die Untersuchung der In-vivo-Wirksamkeit neuer Therapieansätze.
In der vorliegenden Arbeit wurden drei Themenbereiche bearbeitet:
- Bewertung von Doxorubicin-beladenen Polybutylcyanoacrylat (PBCA) Nanopartikel (NP)-Formulierungen,
- Modulation des in Hirnkapillaren exprimierten ATP-Bindungskassetten Transporters ABCG2 durch neu synthetisierte Inhibitoren als eine Strategie zur Überwindung der Blut-Hirnschranke (BHS) durch Zytostatika, die Substrate dieser Effluxpumpe sind, und
- die Verbesserung orthotoper Glioblastom-Modelle in Nacktmäusen, um intracerebrale Tumoren mittels nicht-invasivem optischen Imaging darzustellen.
Humane Glioblastom-Zellen (U-87 MG, U-118 MG und U-373 MG) wurden mit Doxorubicin (Doxo) und Doxorubicin-beladenen PBCA-NP inkubiert. Da diese Zellen weder ABCB1 noch ABCG2 exprimieren, wurden Kb-V1 und MCF-7/Topo Zellen verwendet, um Effekte auf beide Transporter zu untersuchen. Die Zytotoxizität von Doxo und Doxorubicin-beladenen NP Formulierungen war an allen Glioblastom Zellen vergleichbar. Im Gegensatz dazu wurde eine höhere Wirksamkeit der NP Formulierung gegenüber ABCB1 überexprimierenden Kb-V1, jedoch nicht gegenüber ABCG2 exprimierenden MCF-7/Topo Zellen beobachtet. Somit könnten erhöhte Arzneistoff-Konzentrationen im Hirn nach Verabreichung Arzneistoff-beladener NPs, wie in der Literatur berichtet, durch Interaktionen der NPs mit ABCB1 an der BHS erklärt werden.
Die Modulation von ABC Transportern an der BHS stellt eine attraktive Strategie dar, um intrazerebrale Konzentrationen von Substanzen zu erhöhen, die Substrate dieser Transporter sind. Die Identifizierung potenter ABC Inhibitoren ist deshalb ein vielversprechender Ansatzpunkt, um die Chemotherapie von Hirntumoren zu verbessern. Eine Substanzserie, abgeleitet vom ABCB1 Modulator Tariquidar, wurde bezüglich ABCG2 Hemmung und Selektivität gegenüber ABCB1 untersucht. Um das Methodenspektrum zu erweitern und FACS-immanente Probleme zu umgehen, wurden unter Verwendung der fluoreszierenden ABCG2 Substrate Höchst 33342 und Pheophorbid A zwei komplementäre Assays in 96-Lochplatten entwickelt. Interessanterweise führten leichte strukturelle Modifikationen von Tariquidar zu potenten und selektiven ABCG2 Inhibitoren (IC50 des potentesten Modulators: 60 nM im FACS Assay und 65 bzw. 126 nM in den Mikrotiterplattenassays). Im Hinblick auf In-vivo-Studien wurden die potentesten Inhibitoren mittels HPLC-MS bezüglich ihrer Stabilität in Plasma untersucht. Dabei wurde leider eine schnelle enzymatische Spaltung am zentralen Benzamid-Teil gezeigt, so dass diese Substanzen nicht „Drug-like“ sind, und entsprechend verbessert werden müssen. Da in der Literatur über eine Regulation von ABCG2 durch Östrogene berichtet wird, wurden MCF-7/Topo Zellen mit Östradiol behandelt und bezüglich Chemosensitivität gegenüber Topotecan untersucht. Dabei ergab sich kein Unterschied im antiproliferativen Effekt verglichen mit den unbehandelten Kontrollen.
Zur Untersuchung des therapeutischen Nutzens neuer Therapieansätze (z. B. Co-Applikation von selektiven ABC Inhibitoren mit geeigneten Zytostatika), konzentrierte sich diese Arbeit auf die Verfeinerung (refinement) von In-vivo-Xenotransplantat-Modellen. Es wurden orthotope Hirntumor Modelle entwickelt, die intracerebrale Tumorentwicklung mittels nicht-invasivem optischen Imaging verfolgen lassen. Dazu wurden U-87 MG Zellen mit den Genen für Luciferase2 (Luc2) und das rot-fluoreszierende Protein Katushka (Kat) stabil transfiziert. Zahlreiche Klone wurden bezüglich Biolumineszenz / Fluoreszenz, Wachstumskinetik und Chemosensitivität in vitro charakterisiert. Im subkutanen Tumormodell konnten Tumorigenität und langfristiger Erhalt der Luc2 / Kat Expression der Transfektanten nachgewiesen werden. Nach Injektion dieser Zellvarianten ins Hirn von Nacktmäusen entwickelten sich reproduzierbar wachsende Tumoren. Das wohl wichtigste Ergebnis ist die Tatsache, dass die intracerebralen Xenotransplantate mittels beider Imaging-Techniken, nämlich Biolumineszenz und Fluoreszenz, dargestellt werden konnten, und dass eine direkte Korrelation zwischen dem optischen Signal und der histologisch nachgewiesenen Tumorlast besteht.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:12
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