The methylation of CpG dinucleotides represents an epigenetic mark that is crucial for regulating the normal progression of numerous biological processes including development and cell differentiation. During the last decade, it became increasingly clear that methylation patterns are not static but may adapt to various cellular requirements. Regarding normal somatic cells, the dynamic of DNA ...
Zusammenfassung (Englisch)
The methylation of CpG dinucleotides represents an epigenetic mark that is crucial for regulating the normal progression of numerous biological processes including development and cell differentiation. During the last decade, it became increasingly clear that methylation patterns are not static but may adapt to various cellular requirements. Regarding normal somatic cells, the dynamic of DNA methylation including its extent throughout the genome as well as its implication in cellular differentiation is largely unknown. In the context of the present thesis, it was demonstrated that several cell type or cell lineage specific genes harboured a specific methylation profile. Interestingly, those differences in DNA methylation were mostly confined to regions upstream or downstream of the core promoter and preferentially affected CpG poor DNA regions. The gene regulatory relevance of DNA sequences affected by dynamical alterations in the methylation pattern, may be studied by means of transient transfection assays. For this purpose, a novel CpG free luciferase reporter vector was designed that provides a simple and robust tool for analysing effects of DNA methylation within CpG poor as well as CpG rich DNA stretches on gene expression. As particularly the regulated and active removal of methyl CpG marks still remains controversial, the major aim of the present work was the characterization of this epigenetic phenomenon in a natural setting of post mitotic cells: the proliferation independent differentiation of human peripheral blood monocytes into dendritic cells or macrophages, respectively. Using a global, comparative CpG methylation profiling approach that was directed to detect differentially methylated regions in CpG rich as well as CpG poor DNA stretches, 45 examples for active demethylation were identified. The validation by a bisulfite conversion based technique and the characterization of a selected subset revealed that DNA demethylation was not restricted to promoter regions and that the time course varied for individual CpGs. Irrespective of their location, the removal of methylated cytosines strictly coincided with the appearance of activating histone marks indicating the presence of cis acting elements. Since demethylation events were highly reproducible between monocyte derived dendritic cells from distinct donors, the present data suggest that active demethylation is a precisely targeted process. The comparison of the global methylation data with the genome wide mRNA expression profiles demonstrated that active DNA demethylation is not always directly followed by transcriptional activation. Probably, gene activation is a multilevel process that is dependent on various genetic and epigenetic factors. Thereby, CpG demethylation seems to be a necessary prerequisite for priming the chromatin structure for transcription factor binding.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Methylierung von CpG-Dinukleotiden spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung zahlreicher biologischer Prozesse wie zum Beispiel während der Embryonalentwicklung oder der Differenzierung von Vorläuferzellen. Es wird zunehmend deutlicher, dass DNA-Methylierungsmuster nicht statisch sind, sondern, dass sie sich an verschiedene zelluläre Anforderungen anpassen können. In normalen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Methylierung von CpG-Dinukleotiden spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung zahlreicher biologischer Prozesse wie zum Beispiel während der Embryonalentwicklung oder der Differenzierung von Vorläuferzellen. Es wird zunehmend deutlicher, dass DNA-Methylierungsmuster nicht statisch sind, sondern, dass sie sich an verschiedene zelluläre Anforderungen anpassen können. In normalen somatischen Zellen ist jedoch vergleichsweise wenig über die Dynamik von Methylierungsprofilen bekannt. Man weiß weder in welchem Ausmaß solche Veränderungen des Methylierungsstatus auftreten, noch welchen Einfluss diese auf die Differenzierung von gesunden somatischen Zellen haben. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass einige Gene, die in nur einem Zelltyp oder einer Abstammungslinie exprimiert sind, spezifische Methylierungsmuster aufweisen. Interessanterweise waren diese Methylierungsunterschiede hauptsächlich auf CpG arme Regionen außerhalb von proximalen Promotoren beschränkt. Ob die Regionen, die von dynamischen Methylierungsprofilen betroffen sind, die Genexpression beeinflussen, kann mithilfe von transienten Transfektionsexperimenten geklärt werden. Hierfür wurde ein CpG-freier Luciferase-Reportervektor konstruiert, der eine einfache und zuverlässige Analyse sowohl CpG-armer als auch CpG-reicher DNA-Sequenzen erlaubt. Da vor allem die regulierte Entfernung der Methylgruppen von Cytosinen noch immer kontrovers diskutiert wird, stand die Charakterisierung dieses epigenetischen Phänomens in einem post mitotischen Zellsystem (der proliferationsunabhängigen Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen beziehungsweise dendritische Zellen) im Mittelpunkt dieser Arbeit. Mittels Methyl-CpG-Immunpräzipitation, die darauf ausgerichtet wurde, global zelltyp-spezifische Methylierungsunterschiede sowohl in CpG-reichen als auch CpG-armen Regionen zu detektieren, wurden 45 Regionen identifiziert, die während der Differenzierung dendritischer Zellen aktiv demethyliert werden. Die Validierung dieser Regionen mit Hilfe von massenspektrometrischen Analysen bisulfit-konvertierter DNA und die Charakterisierung einiger ausgewählter Loci bestätigte, dass DNA-Demethylierung nicht nur auf Promotorbereiche beschränkt ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Demethylierungsvorgänge an verschiedenen Loci zwar unterschiedliche Zeitabläufe aufweisen, aber immer mit dem Auftreten von aktivierenden Histonmodifikationen einhergehen. Da aktive Demethylierungsereignisse bei verschiedenen Donoren reproduzierbar nachgewiesen werden konnten, sowohl bezüglich des Zeitfensters als auch der Lokalisation der betroffenen CpGs, handelt es sich hierbei um einen streng zielgerichteten Prozess. Der Vergleich der genomweiten Methylierungsdaten mit globalen mRNA Expressionsprofilen zeigte, dass Demethylierung nicht notwendigerweise mit einer sofortigen Veränderung der transkriptionellen Aktivität korreliert. Die Aktivierung von Genen scheint eher ein mehrstufiger Prozess zu sein, der von verschiedenen genetischen und epigenetischen Faktoren abhängt. Die aktive Demethylierung ist hierbei vermutlich ein wichtiger Schritt, um die Chromatinstruktur für die Bindung von spezifischen Transkriptionsfaktoren vorzubereiten.
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